Быстрый метод для визуализации растущего иммобилизованных клеток дрожжей, здесь применяется к флуоресцентным журналистам на молчание спаривания локусов HML и HMR
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрая Техника для визуализации живых иммобилизованных клеток дрожжей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы приведем здесь простой, быстрый и очень гибкий метод для иммобилизации и визуализации растущего дрожжевых клеток путем epifluorescence микроскопии. Техника одинаково хорошо подходит для визуализации статических популяций дрожжей, или время курсы экспериментов до десяти часов в длину. Мой микроскопии расследует эпигенетической наследственности на молчание локуса спаривания в CEREVISIAE С.. Есть два молчание локуса спаривания, HML и HMR, которые обычно не выражены, как они упакованы в гетерохроматин. В sir1 мутант глушителей фоне ослабленной, что каждый локус может быть как в явной или замолчать эпигенетические состояния, так и в популяции в целом есть смесь клеток разных эпигенетические состояния для обоих HML и HMR. Мой микроскопия показала, что нет никакой связи между эпигенетические состояния HML и HMR в отдельной клетки. sir1 клетки стохастически переключатель эпигенетические состояния, установление глушителей на ранее высказанные очага или выражения ранее замолчать локуса. Мое время курс микроскопии гусеничных отдельных sir1 клетки и их потомство, чтобы выиграть частоты каждого из четырех возможных эпигенетические выключатели, и, следовательно, стабильность каждого из эпигенетических государств в sir1 клеток. См. также Xu и соавт., Мол. Сотовые 2006 года.
Протокол
- Иммобилизованные клетки на время микроскопии epifluorescence конечно. Пожалуйста, обратите внимание, что этот протокол используется только если объективы вашего микроскопа ниже столик микроскопа.
- Место клеток в нужной концентрации в жидких средах на длинном покровное (примерно 24x50mm)
- Вырезать агар блок нужного размера из пластмассовая панель СМИ (эти имеют более низкие аутофлюоресценция) и поместите на клетки. Место стороне агара блок не обрабатывается пинцетом в контакт с клетками.
- За короткое время курсы (до 3 часов), это создать достаточно. Если клетки двигаются, когда визуализируется на микроскоп, уменьшение объема клетки или увеличить площадь агар блока.
- Для более длительных курсов время, место капля свежей жидкой среды в верхней части агар блок, и поместите стекло в верхней части агар блока. На этом слайде уменьшает испарение через верх агар блока. При желании, по краям блока агар в контакте с покровным стеклом могут быть запечатаны с вазелином для дальнейшего снижения влажности. Я использовал этот создан для просмотра фильмов до 9 часов в длину, с делением клетки на дикие ставки типа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это быстрый метод, который парализует клетки дрожжей то же время позволяя роста. Мы проследили рост дрожжей на срок до десяти часов, с дрожжами отображения дикие ставки разделения типа в течение всего эксперимента. Заметим, что эта установка требует объектива должны быть ниже столик микроскопа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Пита Хьюстон и Евгения Сю для всех помочь своим.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Xu, E. Y., Zawadzki, K. A., Broach, J. R. Single-cell observations reveal intermediate transcriptional silencing states. Mol. Cell. 23, 219-229 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
