Survivable стереотаксической хирургии в Грызунов

Краткое содержание

Мониторинг внеклеточных уровней нейромедиаторов в различных областях мозга свободно движущихся животных предлагает идеи о связи между выпуска нейротрансмиттера и поведения. В естественных условиях микродиализа в сочетании с электрохимическими обнаружения обеспечивает отличную анатомические и химические разрешение, а также информацию о том, как базальной нейротрансмиссии изменяется с помощью фармакологических или физиологических манипуляций.

Аннотация

Способности измерять базальную внеклеточного уровня нейротрансмиттеров в мозгу проснуться животных позволяет для определения влияния различных системных вызовов (фармакологическая или физиологического) к ЦНС. Например, можно непосредственно оценить, как средний мозг животного прогнозы дофамина реагировать на дофамин-рилизинг наркотики, такие как D-амфетамина или природные раздражители, как пища. В этом видео мы покажем вам, как имплантат руководство канюли, ориентированные на конкретные сайты в головном мозге крыс, как вставить имплантат и микродиализа зонда и как использовать высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическими обнаружения (ВЭЖХ-ЕС) для измерения уровня внеклеточного окисляемых нейротрансмиттеров и метаболитов. Местные точное введение наркотиков через микродиализа зонда позволяет изысканные работы на месте специфику в механизм соединения с действий. Эта техника имеет отличные анатомические и химические разрешение, но лишь скромные временным разрешением, как микродиализа образцы обычно обрабатываются каждые 20-30 минут, чтобы обеспечить определяемый уровень нейромедиатора. Дополнительные бывших естественных инструментов (например, нарежьте и клеточных культур электрофизиологии) может помочь с мониторингом в режиме реального времени нейротрансмиссии.

Протокол

Резюме

Два-месячный средний возраст C57BL/6J мышей или эквивалентную или три месяца средний возраст Sprague Dawley крыс или эквивалента анестезии с кетамином (60 мг / кг для крыс, 100 мг / кг для мышей) и ксилазина (10 мг / кг, внутрибрюшинно или для видов). Торможение осуществляется с использованием нежного ущипнуть палец снять рефлекс продемонстрировано в Walantus и соавт. (Юпитер, 6, 2007) и Szot и соавт. (Юпитер, 9, 2007). Терморегуляция могут быть предоставлены через thermostatregulated грелку (ALA инструменты Inc) и контролируется через ректального термометра. Голова бритая из меха и очищены с йодом перед разрезом. После разреза кожи (2 см в длину для крыс, длиной 1 см для мышей) и удаление всех мягких тканей с поверхности черепа, размещение руководство канюли определяется по отношению к брегмы. 6 мм отверстие сверлится через череп с батарейным питанием бурильщика предназначен для грызунов хирургии (Fine инструменты науки, Inc.) Уход берется так, чтобы сверло не проникает через мембраны мозговых оболочек или кровеносных сосудов. Череп имплантируется с двусторонними 5 мм номер 21 нержавеющая сталь руководство валов, ведущих к задней прилежащем ядре, стриатуме или спинной префронтальной коры головного мозга. Стереотаксического координатами квалифицировались как за Франклин и Paxinos, 1997 (Мышь Мозга в стереотаксического Координаты, Academic Press) или Paxinos и Уотсон, 2006 (Крыса Мозга в стереотаксического Координаты, Академический Press). Имплантаты обеспечены зубным цементом. Болюс лактата Рингера в 0,9% солевом приведен в конце операции (5mls SC у крыс и 1 мл SC у мышей после жидкость нагревают до нормальной температуры тела), чтобы предотвратить обезвоживание. Бупренорфин (0.1-0.5mg/kg SC) осуществляется два раза в день, а затем, по мере необходимости, если животное, кажется, от боли. Местное лечение антибиотиками (бацитрацин мазь) и системные антибиотики (пенициллин 100000 МЕ / кг внутримышечно каждые 12 часов в течение первых 48 часов после ор) находятся в ведении если послеоперационных инфекций происходят.

После операции животным индивидуально в тюрьмах вместе с пищей и водой доступны без ограничений. По крайней мере, одна неделя допускается для восстановления, прежде чем микродиализа и эвтаназии. После восстановления от хирургии, животных передаются клетке микродиализа и микродиализа зондов вставляются и цементировала в гид валы которые были установлены время операции. Зонд вставки не вызывает боли или дискомфорт из-за зонда обход кожи, мышц и менингеальные ткани через руководство шахты. Таким образом, зонд вставки делается без наркоза и анестезии любой-индуцированные эффекты у нейрохимии или поведение избежать. Мы даем зондов стабилизироваться в течение 12 часов, а затем мы начнем отбор проб каждые 30 минут в течение еще 8-12 часов в зависимости от эксперимента. Мы следим за опорно-двигательного поведения животного через фотоэлементы или ручная запись движения экспериментатором. Microdialysate образцы вводятся в высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической обнаружения (ВЭЖХ-ЕС) инструментом нейрохимические обнаружения и анализа. Мы ищем воздействие на базальную нейрохимии и опорно-двигательного поведения. В конце эксперимента животное усыпляют от передозировки системных кетамином (200 мг / кг) и ксилазина (20 мг / кг, внутрибрюшинно). Затем сердце озарен 0,9% физиологического раствора, затем 4% параформальдегида. Мозги удаляются, замороженные и разрезать вдоль тракта микродиализа зонд для проверки точного размещения зонда.

Процедура

1. Настройка стереотаксического прибора и все необходимые материалы. Удостоверьтесь, что местность и инструменты очищаются и стерилизуются.
   
   
2. Сбрить шерсть с электрической бритвой. Переход от ушей только в период между глазами, двигать бритвой в разных направлениях, чтобы эффективно очищать площадь меха. Применить povidine / йода бритой области, но защиты глаз от него.
   
   
3. Горы животных на стереотаксического аппарата путем размещения ухо баров в ушной канал и ужесточение на место. Первое горе одно ухо бар в ушной канал, а затем, удерживая его на месте и слайд в другой бар уха. Вы знаете, вы находитесь в правильном месте, когда голова уже не может быть перемещен из стороны в сторону. Безопасные рот с передней горе стереотаксической и убедитесь, что голову на одном уровне с правителем. Положите линейку в вертикальном положении по отношению к стереотаксической платформы инструмент и проверить его на угол 90 ° между правителем и середине головы животного). Подтвердить это через стереотаксического прибора, если он обеспечивает такую ​​возможность.
   
   
4. Сделайте по передней / задней разрез на коже головы стерильным скальпелем простирается от лямбда только в период между глазами животного. Используйте стерилизованные hemostats к отщипывать кожу и держать разрез открытым. Используя несколько стерильные ватные тампоны, высушить подвергаются поверхности черепа.
   
   
5. Положите руководство канюли на свою гору, найти брегмы на черепе, и положение правой направляющей канюли по этому адресу. Запишите передних / задних и боковых координат. С брегмы, найти правильные координаты, необходимые для размещения вашей зонд с помощью стереотаксической атлас. Позиция руководства канюлю правильные координаты, добавляя или вычитая из брегмы. Принесите ваш гид канюлю вниз, пока не трогает череп, а затем записать этот вентральной координат. Сделайте карандашом метки стерильной карандашом на этом месте на черепе, это, где вы будете бурения.
   
   
6. Удалить руководство канюли и стерилизовать вашего сверла. Тщательно просверлить отверстие в карандаш марки пока вы не получите через ширина черепа. Проконсультируйтесь с руководством канюли чтобы увидеть, если она будет ясно отверстия, не касаясь сторон. Держите бурения и проверки до канюли можно удалить в прямой путь. Как только отверстие сделано, использование стерильных игл, чтобы мягко удар мозговые оболочки, чтобы позволить свободный вставки канюли.
   
   
7. Далее, используя ручной дрелью, сделать шесть отверстий для винтов черепа: два впереди отверстие канюли, два боковых, чтобы отверстие канюли, и два сзади по бокам. Стерилизовать шесть винтов и разместить их на черепе, пока они не плотно, построенной на базе.
   
   
8. Чистая руководство канюли с этанолом и соленые, узлы крепления, и опустите ее медленно, чтобы надлежащим вентральной координат. Убедитесь в том, что стороны не касались, и что он собирается в строго вертикально.
   
   
9. Место якорь винт медиально и позади задних винта черепа и удерживать его на месте с помощью пинцета. Смешайте тонкой партия жидкого стоматологического цемента и охватывают руководство канюли, винты, и остальная часть черепа стерильный шпателем. Сделать еще одну партию, толще это время, и полностью покрыть площадь и канюли и анкерных винтов достаточно, чтобы обеспечить это.
   
   
10. Как цемент становится толще и, прежде чем он затвердевает, отдельные кожу от цемента чашку и плесени цемента чашку с лопаточкой, чтобы убедиться, цемент крышка гладкая все вокруг и не раздражает кожу позже.
    
    
11. Разрешить зубным цементом, чтобы полностью высохнуть, прежде чем снимать животное от аппарата. Удалить hemostats. Применить бацитрацин все наоборот цемента шапку.
    
    
12. Как только животное от стереотаксического прибора, ввести его с 0,25 мл пенициллина IM (внутримышечные), а затем по 1 мл физиологического раствора SC (подкожно).
    
    
13. Место животное в своей клетке и наблюдать за ним, пока не осознает до возвращения его в комнату, чтобы оправиться.
    
    
14. Монитор животных, пока они не оправиться от наркоза на день операции и ежедневно послеоперационной, до конца эксперимента, признаки инфекции и оценки боли / бедственном положении. Это включает в выходные и праздничные дни. Низкий стихийного движения, бедствия вокализации при обработке, выгибание спины, понос, отеки и разряд в области headmount, а также отсутствие кормления / питьевой все признаки боли и страданий. Бупренорфин (0.1-0.5mg/kg SC) осуществляется два раза в день, а затем, по мере необходимости, если животное, кажется, от боли. Местное лечение антибиотиками (бацитрацин мазь) и системные антибиотики (пенициллин 100000 МЕ / кг внутримышечно каждые 12 часов в течение первых 48 часов после ор) находятся в ведении если послеоперационных инфекций происходят. Если любой из этих симптомы сохраняются после введения бупренорфина, дополнительные жидкости, и лечение антибиотиками в течение 12 часов после операции, животное усыпляют.

Обсуждение

В естественных условиях микродиализа является инструментом для измерения нескольких нейротрансмиттеров и метаболитов в различных участках мозга живого животного. Впрочем, это только мониторы внеклеточных уровней нейрохимических веществ и она не дает временное разрешение на мониторе нейромедиатора экзоцитоза в реальном времени. Через версии метода, называемого "чистого потока", фактическая концентрация медиатора на данном сайте можно рассчитать, что, в свою очередь, может дать точные измерения нейромедиатора скорость обратного захв...

Материалы

Материалы изложены в протоколе документ