Это видео демонстрирует, 2-цветный целом монтировать на месте гибридизация, метод, которым пространственной и временной экспрессии в 2 разные гены могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Дэвид Уилкинсон, Домингос Энрике, Фил Ингам и Дэвид Иш-Horowicz.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения экспрессии генов в мозге, нервной трубки, сомитов и формирование зачатков сердца. Это видео демонстрирует различные этапы в 2-х цветный целом монтировать на месте гибридизации; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эмбрион обрабатывается для prehybridization. Эмбрион, то гибридизированных с двумя различными датчиками, один связан с DIG, а один связан с FITC. После ночи гибридизации, эмбрион инкубировали с антителами DIG связаны. Цветная реакция на подложке DIG выполняется, и область интереса появляется синий. Эмбрион затем инкубировали с FITC связанных антител. Эмбриона обрабатывается для цветной реакции с FITC, и область интереса появляется красное. Наконец, эмбрион является фиксированной и обработаны для phtograph и секционирования. Руководство по устранению неисправностей также представлен.
Протокол
Часть 1: Крепление эмбрионов
- Заполните рассечение блюдо с ледяной DEPC-би-эс. Держите на льду. Открытое яйца, нажав оболочки щипцами и удалить оболочку штук.
- Удалить толстые альбумина щипцами. Tilt желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
- Использование ножницы, разрезать квадрат желточного мешка вокруг эмбриона.
- Использование ложкой, удалить эмбрион с желтком и поставьте на лед холодной DEPC-би-эс.
- Под микроскопом, удалите мембраны и желток и трансфер в фиксации блюдо.
- Pin вниз, удалить DEPC-би-эс. Заменить на 4% PFA в DEPC-би-эс и исправить O / N при 4 ° C.
- Удалить фиксатором. Замените ледяной DEPC-би-эс. Использование тупым концом иглы или микрокапиллярных микродиссекции нож, перфорировать нервной системы и полостей сердца, чтобы предотвратить захват зонда.
- Вымойте 2x 10 млн. DEPC-PBS с 0,1% Твин-20 (PBT). Дегидрировать 10 млн. каждый на 25%, 50%, 75% метанола в PBT. Дегидрировать эмбрионов два раза в 100% метанола. Хранить при температуре от -20 ° C в метаноле.
Часть 2: Prehybridization
- Увлажняет эмбрионов 10 млн. каждый на 75%, 50% и 25% метанола в PBT. Вымойте 2x 10 млн. в PBT.
- Между тем, готовить ледяной фиксатор (4% параформальдегида в PBT). Замените PBT с протеиназы К решению (3 мл / флакон; [? 5 г / мл] финала в PBT). Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К, осторожно вращая флакон, см. Поиск и устранение неисправностей для экспозиции.
- Использование РНКазы свободной пипетки Пастера удалить протеиназы К и добавить фиксатор (2 мл). Сразу же место на льду ровно 20 млн.
- Все РТ моет выполняются на nutator. Вымойте 2x 10 млн. в PBT, и 1x 10mn в PBT, содержащей 50% гибридизации буфера.
- Вымойте 1x в гибридизации буфера. Инкубировать при 65 ° С в 2 мл буфера для гибридизации 4-5 часов.
Часть 3: гибридизации эмбрионов с зондами
- DIG и FITC связанных зонд синтез описан в Приложении. Зонд должны дать сильный сигнал, должно быть synhesized с FITC-содержащих нуклеотидов; слабее зонд должен быть синтезирован с с DIG-содержащих нуклеотидов.
- Prewarm зондов при гибридизации буфер (500 нг / мл) с использованием 2 мл флакон. Незамедлительно заменить гибридизации буфер с зондом решение. Не позволяйте эмбрионов сухой. Инкубируйте в течение 16 ч при 65 ° C.
- Замените датчик с гибридизации буфер, 2 мойки, 30 млн. каждый при температуре 65 ° C. Вымойте 15 млн. в буфере гибридизации / MABT (1 / 1 о / о /) при 65 ° C.
Часть 4: DIG инкубации антитела и цветной реакции
- Вымойте 2x20 млн. в MABT. Промыть 1 час в 2% BBR / MABT. Вымойте 5 часов в 2% BBR/20% HISS / MABT (блокирующего буфера). Инкубируйте в 1:2000 DIG антител разводят в блокирующем буфере, O / N при температуре 4 ° С на nutator.
- Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
- Вымойте 2x 20 млн. в NTMT. Добавить 200ul НБТ / BCIP подложки до 10 мл NTMT. Немедленно удалите из флакона NTMT и заменить 1-2 мл НБТ / BCIP буфера. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 20 млн, а на 20 млн интервалами в дальнейшем.
- После цветной реакции (должен появиться синий), умойся в PBS в течение 10 мин, придавить на фиксацию блюдо заполнено PBS, и заменить решение с 4% PFA в PBS. Fix O / N при 4 ° C.
- Переезд в новый флакон сцинтилляции. Стирать в PBST (PBS с 1% Твин-20) 2х10 мин. Стирать в MABT 2x 10 мин.
- Инкубируйте в MABT 30 млн. на 63 ° C.
Часть 5: FITC инкубации антитела и цветной реакции
- Вымойте 2x 10 млн. в MABT, 1 час в 2% BBR / MABT, 5 часов в блокирующем буфере
- Инкубируйте в щелочной фосфатазы связью анти-FITC-антител (1:500) O / N при 4 ° C.
- Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
- Стирать в 2x 20 млн. в TBS рН 8,45 с 0,1% Твин-20 (TBST).
- Подготовка векторного Красной рабочего раствора (5 мл) в TBST с использованием реагентов 1,2 и 3 представлены в комплекте. Немедленно удалите из флакона TBST и заменить с буфером Векторный Red. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 40 млн., а на 30 млн интервалами в дальнейшем.
- После цветной реакции (должны появиться красные), трансфер эмбрионов PBS.
Часть 6: фиксации и обработки
- Трансфер в фиксации блюдо с PBS, и исправить в 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре или O / N при 4 ° C.
- Стирать в PBS, 2x 10 мин. Для обработки для фотографии, трансфер в 20% глицерина в PBS (это сделает эмбрионов полупрозрачные). Чтобы создать камеру, вырезать 2 полоски ленты ПВХ, наложить их на слайде. Сокращение площади в центре с помощью ножа. Снять квадратные использованием щипцов.
- Чтобы обработать воском для секционирования, трансфер обратно в PBS, мыть 2x 10 млн., обезвоживают в градуированных серии метанола (25%, 50%, 75% и 100% в ФСБ, 10 млн каждый).
- Замените пропанол, 3mn. Замените 1,2,3,4-тетрагидронафталина, 20 млн. следуют Histoclear (2x 1 час). Замените histoclear / воск 1 / 1 (об / об) 60 ° С в течение 1 часа. Замените воском процесспо гистологии.
Часть 7: Решения
Гибридизация буфер, хранят при температуре -20 ° С в Сокол, 50 мл: 25 мл формамида; 3,25 мл (20xSSC), 0,5 мл (0,5 М ЭДТА), 1 мл (10% Твин-20); 2,5 мл (1% SDS) ; 125 UL (20mg/ml тРНК);. 100 мкл (50 мг / мл гепарина) MABT, подготовить 100mM малеиновой кислоты, рН до 7,5 NaOH гранул. Добавить 150 мМ NaCl и 0,1% Твин-20.
NTMT (сделанные непосредственно перед использованием), 50 мл: 1 мл (5М NaCl), 2,5 мл (2 М Трис-HCl pH9.5); 1,25 мл (2M MgCl 2), 5 мл (10% Твин-20).
TBST: 0,1 М Трис-HCl, 0,15 М NaCl, рН 8,45, 0,1% Твин-20.
Часть 8: Поиск и устранение неисправностей
| Проблема | Вызывать | Средство |
|---|---|---|
| Эмбриона, свернувшись калачиком | Недостаточное дегидратации / регидратации | Поддерживать 10 млн. промежутки времени в течение последовательных дегидратации / регидратации шаги |
| Существует нет сигнала датчика | Зонд деградированных загрязнения РНКазы во флаконе | Выполнить зонда на 1% агарозном геле Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К в шаге 2 |
| Зонд этикетки полостей сердца нервной трубки | Зонд в ловушке | В шаге 2, чтобы убедиться, что все полости перфорированы использованием микродиссекции ножом или микрокапиллярных |
| Эмбрион распался следующие гибридизации (шаг 3) | Протеиназы К шаг влево слишком долго Гибридизация слишком высокая температура | Протеиназы К не следует оставлять более 1 миллиона (стадии 3 + и 4), 2 млн. (этап 5 до 7), 3 млн (стадия 8-10), 4 млн (стадии 11-13) Не гибридизации при Т о высших чем на 65 ° С |
Часть 9: Представитель Результаты
Представитель эмбрионов приведены ниже: (А) Эмбрион (стадия HH7) помечена DIG-Сокс зонд (синий) и FITC-дельта-1 зонда (красный). (B) Эмбрион (стадия HH8) помечена DIG-Pax6 зонд (синий) и FITC-Тсс зонд (красный). Nf, нейронные раза, ANP, передней нервной пластинки, PSM, presomitic мезодермы, п, хорды, NT, нервной трубки). Зонд подарки от лаборатории д-ра. С. Табин, М. Гулдинг, Д. Энрике, Дж. Бриско. 
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
2-цветная целом монтировать на месте методом гибридизации используется для определения пространственных и временных закономерностей изменения экспрессии генов, с помощью одного или двух генов, представляющих интерес. Приложения включают в себя оценку генной экспрессии новых генов (например, 1,2, а также изменения в экспрессии генов следующим оскорбление (эмбриональных манипуляций 3, бусины 4 и электропорации РНК или ДНК-конструкции 5).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Благодарности
Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Яйца | Животное | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Стереомикроскоп | Микроскоп | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Автоматический инкубатор Marsh | Оборудование | Lyon | RX | |
| Инкубатор для гибридизации | Оборудование | Hybaid | Micro-4 | |
| Орбитальный миксер Adams Nutator | Оборудование | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Изогнутый пинцет (1) | Оборудование | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Тонкие ножницы | Оборудование | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Ложка | Оборудование | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Капиллярная пипетка Пастера | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Микрокапиллярная трубка | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Вытянуть с помощью вертикального микропипетного вытягивателя; затупить конец тонким пинцетом | |
| Нож для микродиссекции | Fine Science Tools | 10056-12 | Использовать для прокалывания полостей перед гибридизацией in situ | |
| Булавки Minuten, диам. 0.2mm | Fine Science Tools | 26002-20 | Хранить булавки вместе с помощью магнитного перемешивателя; | |
| Отвердитель и основа силиконового эластомера Sylgard 184 | Реагент | Dow Corning | 0001986475 | Смешать 1 часть отвердителя и 9 частей основы; оставить на ночь при 37°C |
| Диэтилпирокарбонат (depc) | Реагент | Acros Organics | 10025025 | Добавить 1ml depc к 1l PBS; встряхнуть; автоклавировать |
| 16% PFA | Реагент | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Реагент | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Протеиназа K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Стоковый раствор 10 mg/ml в depc-H₂O в аликвотах по 10µl. Хранить при -20°C. | |
| Формамид, деионизированный | Реагент | Ambion | 9342 | |
| тРНК дрожжей-25 mg | Реагент | Invitrogen | 15401-011 | Стоковый раствор 20 mg/ml в depc-H₂O в аликвотах по 125µl. Хранить при -20°C |
| Гепарин натриевая соль | Реагент | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Стоковый раствор 50 mg/ml в depc-H₂O в аликвотах по 100µl. Хранить при -20°C. |
| SSC x20 pH5.5 | Реагент | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Реагент | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Малеиновая кислота | Реагент | Fluka | 63189 | |
| Блокирующий реагент B–hringer | Реагент | Roche Group | 11096176001 | Использовать в концентрации 2% в MABT. Для приготовления нагревать с MABT в течение 20 мин при 60°C. Можно приготовить стоковый раствор и хранить в аликвотах по 1-5 ml при 20°C. |
| Термоинактивированная сыворотка овцы | Реагент | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Растворить в 10 ml H₂O; нагревать при 55°C в течение 30 мин. Разлить по аликвотам по 1ml, хранить при -20°C. |
| Анти-Дигоксигенин-AP, Fab-фрагменты | Реагент | Roche Group | 11093274910 | |
| Стоковый раствор NBT/BCIP | Реагент | Roche Group | 11681451001 | |
| Анти-Флуоресцеин-AP, Fab-фрагменты | Реагент | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Набор субстрата щелочной фосфатазы Vector Red | Реагент | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-тетрагидронафталин | Реагент | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | В вытяжном шкафу |
Ссылки
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
