Асептический метод в науке об окружающей среде

1. Подготовка к асептическим работам

1. Приобретите и используйте следующие средства индивидуальной защиты: лабораторный халат, латексные или нитриловые перчатки (без разрывов и дыр) и защитные очки (Рисунок 1). Для безопасности в случае использования открытого огня завяжите назад длинные волосы.
   
   Рисунок 1: СИЗ: лабораторный халат, латексные перчатки и защитные очки.
2. Вторым важным аспектом асептической техники является надлежащая стерилизация и хранение сред/реагентов, которые будут использоваться в лаборатории. Приготовьте жидкую среду для бульона (, например, , триптический соевый бульон) и среду на основе агара (, например, R2A), взвесив нужное количество высушенного базового порошка, который добавляют к соответствующему количеству деионизированной воды.
3. Для бульонной среды растворите порошок на горячей пластине при слабом нагреве и дозируйте жидкость либо в объемах по 100 мл в стеклянные колбы с завинчивающейся крышкой, либо в объемах по 10 мл в стеклянные пробирки с завинчивающейся крышкой. С помощью магнитной мешалки перемешайте агарозную среду на мешалке с горячей плитой до полного растворения порошка.
4. Наклейте автоклавную ленту на контейнеры и автоклавируйте носитель в соответствии с инструкциями производителя (e.Например, 20 мин при 121 °C) (Рисунки 2 и 3). Обратите внимание, что цвет полос на автоклавной ленте должен меняться с белого (доавтоклавный) на черный (поставтоклавный). Хотя изменение цвета в целом указывает на то, что стерилизация прошла успешно, для проверки процесса автоклавирования можно провести проверку стерильности с использованием наборов споровых полосок.
   
   Рисунок 2: Автоклавная лента наносится на материал.
   
   Рисунок 3: Обратите внимание на изменение цвета полос на автоклавной ленте с белого (до автоклава) на черный (после автоклава).
5. Охладите жидкие бульоны до комнатной температуры, а затем храните при комнатной температуре или в холодильнике при 4 °C.
6. Охладите агарозную среду, поставив емкость на водяную баню, установленную на ~50 °C. После охлаждения среду можно разлить в стерильные чашки Петри. Дайте среде остыть и застыть, затем консолидируйте для хранения при температурах, указанных производителем.
7. Существует несколько разновидностей питательных сред, которые не могут быть автоклавированы, так как высокие температуры разрушают критически важные ингредиенты. Для их стерилизации требуется фильтр-стерилизация с использованием вакуумной системы фильтрации с использованием фильтра толщиной 0,22 мкм с последующим хранением при соответствующей температуре.
8. Перед выполнением работ на столе продезинфицируйте поверхность подходящим раствором (, например, , отбеливатель 500 ppm). Это снижает риск переноса загрязнений с рабочей поверхности на культуры и стерильные среды.
9. Чтобы установить стерильное поле, включите горелку Бунзена. Тип пламени, наиболее подходящий для стерилизации контуров модифицирования металлов, представляет собой интенсивное синее пламя с четко выраженным синим конусом посередине (Рисунок 4).
   
   Рисунок 4: Перенос бактерий с одной пластины Петри, демонстрирующей рост культивируемого изолята, на другую неинокулированную пластину Петри, содержащую питательную среду на основе агара.
10. Медленно пропустите завивочную петлю через самую горячую часть пламени (кончик синего конуса). Петля должна раскалиться докрасна с целью стерилизации.

2. Перенос бактерий: от пластины Петри к пластине Петри

1. Один из сценариев переноса бактерий заключается в переносе бактерий с одной пластины Петри, демонстрирующей рост культивируемого изолята, на другую, стерильную пластину Петри, содержащую питательную среду на основе агара.
2. Для начала слегка приоткройте пластину Петри, содержащую чистую бактериальную культуру, и осторожно постучите горячей стерилизованной инокуляционной петлей по поверхности агара.
3. Извлеките одну изолированную колонию с поверхности пластины с помощью охлажденной инокуляционной петли и закройте пластину Петри.
4. Выполните полосу для изоляции с помощью свежей чашки Петри, содержащей питательную среду, со слегка приоткрытой крышкой.
5. Для каждой порции изоляционной полосы (всего 3 на пластину) простилизуйте пламенем контур инокуляции непосредственно перед использованием. Кроме того, необходимо стерилизовать петлю пламенем сразу после выполнения финальной полосы, чтобы предотвратить загрязнение поверхности стола и в качестве фактора для других сотрудников лаборатории, которые впоследствии могут использовать петли для прививки или вступить в контакт с ними.
6. Поместите прожилки пластин в инкубатор для роста на ночь.

3. Перенос бактерий: от бульонной культуры к пластине Петри

1. Второй сценарий переноса бактерий происходит из бульонной культуры, демонстрирующей рост, как обычно наблюдается по мутности, в стерильную пластину Петри, содержащую питательную среду.
2. Снимите крышку с пробирки (или колбы), содержащей чистую бактериальную культуру, и пропустите отверстие контейнера 2-3 раза через самую горячую часть пламени. Во избежание загрязнения не опускайте колпачок на столешницу.
3. Осторожно опустите стерилизованную инокуляционную петлю в пробирку/колбу и осторожно прижмите к стенке контейнера для охлаждения непосредственно перед введением в бульонную культуру.
4. Удалите одну петлю бульонной культуры (Рисунок 5) и немедленно установите крышку на место.
   
   Рисунок 5: Одна петля бульонной культуры.
5. Выполните полосу для выделения с помощью свежей чашки Петри, содержащей питательную среду, со слегка приоткрытой крышкой.
6. Для каждой порции полосы (всего 3 на пластину) простерилизуйте контур закваски непосредственно перед использованием. Кроме того, стерилизуйте петлю пламенем сразу после выполнения финальной полосы, чтобы предотвратить загрязнение поверхности стола и в качестве соображения для других сотрудников лаборатории, которые впоследствии могут использовать петли для прививки.
7. Поместите прожилки для изоляции в инкубатор для роста на ночь.

4. Перенос бактерий: от пластины Петри с ростом к стерильной жидкой среде

1. Третий сценарий переноса бактерий — из чашки Петри, содержащей изолированную полосу культуры, в пробирку/колбу, содержащую стерильную жидкую питательную среду.
2. Слегка приоткройте пластину Петри, содержащую чистую бактериальную культуру, и охладите горячую инокуляционную петлю, осторожно постучав ею по поверхности агара.
3. Извлеките одну изолированную колонию с поверхности пластины с помощью охлажденной инокуляционной петли и закройте пластину Петри.
4. Снимите колпачок с пробирки (или колбы), содержащей стерильную жидкую питательную среду, и пропустите отверстие контейнера 2-3 раза через самую горячую часть пламени. Во избежание загрязнения не опускайте колпачок на столе.
5. Осторожно опустите извлеченную колонию в жидкую среду бульона, и аккуратно взбалтывайте петлю с целью высвобождения бактерий. Немедленно установите колпачок на место.
6. Стерилизуйте петлю модифицирования пламенем, чтобы предотвратить загрязнение поверхности стола и в качестве предупреждения для других сотрудников лаборатории, которые впоследствии могут использовать петли для модификации.
7. Поместите колбу в инкубатор для роста на ночь.
8. Выньте колбу из инкубации на следующий день. Выполните ряд разбавлений, чтобы перечислить культуру.
9. Поместите разведения из ряда на тарелки на среду для агарозных культур и инкубируйте планшеты в течение ночи.
10. Снимите пластины на следующий день и понаблюдайте за любыми загрязнениями.

5. Бактериальный перенос: от бульонной культуры к стерильной жидкой питательной среде

1. Четвертый сценарий переноса бактерий происходит из бульонной культуры, демонстрирующей рост, в пробирку/колбу, содержащую стерильную жидкую питательную среду.
2. Снимите крышку с пробирки (или колбы), содержащей чистую бактериальную культуру, и дважды пропустите отверстие контейнера через самую горячую часть пламени. Во избежание загрязнения не опускайте колпачок на столешницу.
3. Осторожно опустите инокуляционную петлю в пробирку/колбу и осторожно прижмите к стенке контейнера, чтобы остыть непосредственно перед введением в бульонную культуру.
4. Извлеките одну петельку из бульона культуры, и сразу же установите на место крышку.
5. Снимите колпачок с пробирки (или колбы), содержащей стерильную жидкую питательную среду, и дважды пропустите отверстие контейнера через самую горячую часть пламени. Во избежание загрязнения не опускайте колпачок на столешницу.
6. Осторожно опустите извлеченную петлю в стерильную жидкую среду бульона, и аккуратно взбалтывайте петлю с целью высвобождения бактерий. Немедленно установите колпачок на место.
7. Простерилизуйте контур модифицирования пламенем (Рисунок 6) для предотвращения загрязнения поверхности стола и в качестве соображения для других сотрудников лаборатории, которые впоследствии могут использовать контуры для модифицирования.
   
   Рисунок 6: Контур инокуляции нагревается докрасна во время стерилизации с помощью горелки Бунзена.
8. Поместите колбу в инкубатор для роста на ночь.
9. Выньте колбу из инкубации на следующий день. Выполните ряд разбавлений, чтобы перечислить культуру.
10. Поместите разведения из ряда на тарелки на среду для агарозных культур и инкубируйте планшеты в течение ночи.
11. Снимите пластины на следующий день и понаблюдайте за любыми загрязнениями.