Асептический метод в науке об окружающей среде

Асептический метод является фундаментальным навыком в микробиологии и имеет решающее применение в исследованиях окружающей среды.

Если микробиологические культуры загрязнены, время, труд и финансовые затраты, которые потребовались бы от лаборатории для «очистки» или замены культур, особенно редких изолятов из уникальной среды, могут быть очень высокими и непомерно высокими, а некоторые образцы могут оказаться незаменимыми.

Правильное использование асептических методов снижает вероятность бактериального и грибкового загрязнения реагентов, питательных сред и образцов окружающей среды, а также позволяет избежать перекрестного загрязнения между образцами. Это также мера безопасности, которая снижает потенциальную передачу микробов экспериментатору, что особенно важно при работе с патогенами.

В этом видео мы познакомим вас с принципами асептики; несколько важных методов поддержания стерильности реагентов и культур; и, наконец, некоторые из их применений в науке об окружающей среде.

Целью использования асептических методов является создание и поддержание стерильной рабочей среды, оборудования и реагентов, чтобы свести к минимуму загрязнение биологических образцов. Распространенными источниками загрязнения являются микроорганизмы, находящиеся в воздухе, микробы, присутствующие на лабораторном столе или оборудовании, а также микробы, присутствующие в волосах, теле и одежде исследователя.

Два типа агентов играют центральную роль в удалении или предотвращении загрязнения в лаборатории: дезинфицирующие химикаты и тепло. Такие растворы, как 70% этанол и разбавленный отбеливатель, часто используются для дезинфекции оборудования, рабочих поверхностей и перчаток экспериментаторов перед началом асептических работ.

В то же время микробы на инструментах, стеклянной посуде и жидких средах могут быть подвергнуты термическому уничтожению в автоклаве, который представляет собой камеру, стерилизующую содержимое путем воздействия высокотемпературного пара под давлением. Кроме того, такие инструменты, как стеклянные стержни, используемые для нанесения покрытия, и петли для модифицирования металла, могут быть подвергнуты термической стерилизации с помощью источника пламени, такого как горелка Бунзена.

Использование источника пламени также является одним из наиболее распространенных способов создания асептической рабочей среды. Тепло от пламени вызывает конвекцию воздуха, создавая восходящий поток, который поднимает любые загрязняющие вещества в воздухе подальше от горелки и создает «стерильное поле» для проведения асептических экспериментальных работ.

Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе асептических методов, и почему они важны, давайте рассмотрим протокол создания асептической рабочей среды, создания стерильных питательных сред и асептического переноса бактерий между различными условиями культивирования.

Прежде чем приступить к асептической работе, экспериментатору важно надеть надлежащие средства индивидуальной защиты или СИЗ. Цель этого состоит в том, чтобы предотвратить загрязнение образцов и лабораторных культур экспериментатором, а также предотвратить передачу потенциально патогенных микробов исследователю. Предметы СИЗ включают лабораторный халат, перчатки и защитные очки.

Следующим шагом является надлежащая стерилизация и хранение питательных сред, которые будут использоваться для культивирования образцов микроорганизмов. Во-первых, отвесьте необходимое количество компонентов твердой среды и добавьте их в надлежащий объем жидкого растворителя, указанный производителем, например, деионизированную воду, в автоклавируемый контейнер Добавьте магнитную мешалку, поместите контейнер на мешалку с горячей плитой и растворите твердые компоненты среды при слабом огне и перемешивании.

Закройте средние емкости. Если вы используете стеклянный сосуд с завинчивающейся крышкой, обязательно не затягивайте крышку полностью, так как воздух внутри сосудов будет расширяться из-за нагрева во время автоклавирования и должен будет выходить. Без утечки газ может привести к разрыву сосуда. Наденьте на сосуды кусок автоклавной ленты и автоклавируйте среду в соответствии с инструкциями производителя, например, 20 минут при температуре 121 °C. После автоклавирования убедитесь, что полосы на автоклавных лентах стали черными, что указывает на достижение надлежащей температуры.

Жидким питательным средам дайте им остыть до комнатной температуры и храните при комнатной температуре или в холодильнике, в зависимости от обстоятельств. Для твердых питательных сред на основе агара дайте им остыть примерно до 50 ? С, затем разлить в стерильные чашки Петри. Дайте агару остыть и затвердеть перед хранением при соответствующей температуре.

Для сред, которые не могут быть автоклавированы из-за наличия термочувствительных компонентов, фильтр следует стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.

Основным методом микробиологической работы является асептический перенос бактериальных культур между различными питательными средами, как твердыми, так и жидкими. Прежде чем начать, очистите поверхность лабораторного стола дезинфицирующим средством. Это снижает риск загрязнения культур или стерильных сред.

Для переноса бактериальных культур обычно используется инструмент, называемый инокуляционным контуром, который необходимо стерилизовать перед использованием путем нагревания в пламени.

Включите источник пламени. Медленно пропустите инокуляционную петлю через кончик пламени. Петля раскалится докрасна. Чтобы перенести колонию бактерий из твердой агаровой пластины, слегка приоткройте пластину Петри и осторожно постучите горячей инокуляционной петлей по пустой части поверхности агара, чтобы избежать теплового уничтожения бактерий. Соскребите одну колонию с помощью петли для прививки и закройте пластину.

Чтобы перенести бактерии из жидкой питательной среды, снимите крышку с емкости для культуры. Чтобы предотвратить загрязнение, не опускайте крышку на стол. Пропустите горлышко емкости 2-3 раза через самую горячую часть пламени. Затем осторожно прикоснитесь горячей стерилизованной петлей для инокуляции к внутренней стороне контейнера и дайте ей остыть, прежде чем вставлять ее в бульонную культуру. Удалите одну петельку культуры, и сразу же закройте крышку.

Для переноса полученных бактерий в стерильную питательную среду снимите крышку с емкости со стерильным бульоном и пропустите отверстие емкости через пламя 2-3 раза. Затем осторожно опустите петлю для посева в среду и осторожно взбалтывайте, чтобы выпустить бактерии. Немедленно закройте крышку. Простерилизуйте петлю для инокуляции после использования.

При переносе бактерий на стерильную агаровую пластину откройте крышку свежей чашки Петри с неинокулированным агаром. Прокрутите петлю инокуляции с бактериальной культурой вперед и назад по одному сектору агара. Простерилизуйте петлю и охладите ее, коснувшись пустой части агара, затем сделайте еще одну полосу на агаре под тупым углом к первой полосе, стараясь пересечь первую полосу на первых 1-2 ударах, но не касаясь первой полосы при последующих ударах. Повторите стерилизацию и полосатость еще 2 раза. Закройте пластину Петри, и простерилизуйте петлю прививки.

После инокуляции бульон или агаровая пластина должны быть инкубированы при идеальной температуре роста данного микроорганизма для получения жизнеспособной культуры. На твердой среде газон или непрерывная полоса бактерий будет видна на агаре, покрытом первыми двумя полосами, но отдельные колонии должны быть получены на последней полосе. Плохая асептическая техника приведет к росту плесени и других загрязнений на пластине.

Асептические методы важны во многих экспериментах с использованием микробных образцов из окружающей среды. В этом исследовании ученые выделили бактериофагов, которые являются вирусами, заражающими бактерии, от обычной почвенной бактерии Arthrobacter. Культуры Arthrobacter впервые выращивали в асептических условиях. Затем образцы почвы промывали и фильтровали в фаговом буфере, а фаговый раствор смешивали с бактериальной культурой и наносили на агаровые пластины. На пластине образуется бактериальная лужайка, но в местах, где вирус заразил и убил бактерии, будут поляны, или «бляшки». Затем фаг может быть очищен от этих бляшек для дальнейшего изучения.

Помимо использования горелок Бунзена, асептические рабочие среды также могут поддерживаться на специализированных рабочих станциях, известных как колпаки с ламинарным потоком, в которых используется направленный поток воздуха и фильтры для поддержания стерильности. Здесь ученые работали в проточном колпаке, чтобы изолировать потенциальные патогенные бактерии и вирусы из проб воды. Затем эти изоляты культивировались вместе с амебами. Поскольку амебы обычно питаются или «фагоцитируют» бактерии, любые бактерии, которые были способны сопротивляться перевариванию амеб и оставаться в этих организмах, также потенциально могут оставаться жизнеспособными в клетках человека и вызывать заболевания.

Наконец, стерильные условия позволяют детально изучить экологические механизмы, такие как образование корневых клубеньков у бобовых растений - органов, заполненных бактериями, которые «фиксируют» атмосферный азот в аммиак, который используется растением для роста. Исследователи создали «микрокосмы» для изучения процесса образования клубеньков с использованием пластин Петри с питательной средой для растений, поместили в них рассаду и инокулировали сеянцы ризобиальными бактериями, образующими клубеньки. Асептическая среда проточного колпака предотвращает заражение культур другими бактериями или грибками.

Вы только что посмотрели видео JoVE об асептических методах в науке об окружающей среде. Теперь вы должны понять, почему важны асептические условия труда; как асептически проводить микробиологические эксперименты; и некоторые виды применения асептических методов в экологических исследованиях. Как всегда, спасибо за просмотр!