Тестирование генетически модифицированных продуктов питания

Генетически модифицированные продукты — это продукты, которые содержат ингредиент или ингредиенты, ДНК которых была специально изменена. Присутствие этих модификаций может быть обнаружено с помощью метода, называемого полимеразной цепной реакцией.

Генетическая модификация продуктов питания является спорным вопросом из-за спорных опасений по поводу здоровья и экологической безопасности. Возможность обнаружения генетически измененной ДНК в образцах продуктов питания, представляющих интерес, позволяет принимать обоснованные решения о безопасности и потенциальной опасности использования генетически модифицированных организмов (ГМО) в продуктах питания.

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, используется для амплификации пищевой ДНК для определения наличия или отсутствия генетически модифицированных последовательностей. Затем гель-электрофорез протягивает амплифицированную ДНК через агарозную гелевую матрицу и разделяет полосы ДНК разного размера, которые соответствуют модифицированным или немодифицированным маркерам. Затем их сравнивают с контрольными полосами из продуктов, о которых известно, что они содержат ГМО или не содержат модификаций.

В этом видео будут проиллюстрированы принципы обнаружения генетически модифицированной ДНК в образцах продуктов питания, способы извлечения ДНК и амплификации маркеров, используемых в процессе генетической модификации, а также способы установления наличия или отсутствия ГМО в образцах продуктов питания.

Полимеразная цепная реакция идентифицирует последовательности ДНК, которые были вставлены в генетически модифицированную пищу. ДНК является относительно стабильной молекулой, поэтому жизнеспособные фрагменты ДНК, пригодные для амплификации, могут быть выделены даже из продуктов с высокой степенью переработки, таких как кукурузные чипсы или овощные гамбургеры. Небольшое количество регуляторных последовательностей ДНК используется для контроля экспрессии вставленных генов, поэтому эти последовательности присутствуют в большинстве ГМ-культур. Эта процедура выявляет два наиболее часто используемых гена: ген промотора 35S и ген-терминатор нопалинсинтазы. Последовательность 35S± является сильным промотором, и при присоединении к вставленному гену будет стимулировать постоянный, высокий уровень экспрессии. Терминатор нопалинсинтазы включается для остановки транскрипции вставленного гена в желаемой конечной точке.

ПЦР включает в себя повторяющиеся циклы нагрева и охлаждения в термоамплификаторе, машине, которая строго контролирует температуру реакционных пробирок ПЦР. Нагрев образца до 94 ? С приводит к денатурации и разделению нитей ДНК. Быстрое охлаждение до 45-65 ? C позволяет праймерам отжигать на отделенных нитях ДНК. Наконец, подогрев до 72 ? C позволяет ферменту Taq-полимеразе удлинять праймеры и полностью дуплицировать целевую область.

Купленный растительный праймер добавляется к каждому образцу, и будет амплифицироваться в образцах, содержащих растительную ДНК. ГМО-положительные шаблоны для 35S и NOS используются для обеспечения положительного контроля за ГМО. Сертифицированный препарат без ГМО используется в качестве отрицательного контроля. Если какая-либо из этих контрольных реакций показывает неожиданные полосы, результатам тестовых образцов нельзя доверять.

Амплифицированная ДНК пропускается через агарозный гель с помощью электрофореза. Продукты ПЦР смешиваются с красителем и загружаются в лунки. ДНК заряжена отрицательно, и при загрузке в гель на катодном конце камеры при подаче тока она будет двигаться к анодному концу. Более крупные фрагменты ДНК не могут так легко перемещаться по гелевой матрице, поэтому остаются ближе к катоду, в то время как меньшие последовательности движутся к концу анода, что приводит к разделению ДНК разного размера на отдельные полосы.

После электрофореза окрашивание гелем помогает визуализировать разделенные полосы ДНК.

Теперь, когда мы знакомы с принципами обнаружения ГМО и использованием ПЦР и электрофореза для идентификации ГМО, давайте рассмотрим, как это можно сделать в лаборатории.

После того, как интересующие вас пищевые продукты были идентифицированы, можно приступать к анализу. Чтобы извлечь ДНК, возьмите две чистые пробирки с завинчивающейся крышкой, и в каждую из них перенесите по 500 ? L купленного реактива для выделения ДНК, обязательно пипетируя смесь вверх и вниз между аликвотами, чтобы равномерно перемешать реагент. Пометьте одну из пробирок «без ГМО», а другую «Тест».

Затем взвесьте 0,5 г сертифицированных продуктов без ГМО и поместите в чистую ступку. Добавьте 2,5 мл дистиллированной воды, и растирайте пестиком в течение 2 минут до образования кашицы. Добавьте еще 2,5 мл дистиллированной воды и продолжайте измельчать суспензию, пока она не станет достаточно гладкой для пипетки.

Пипетка 50 ? L известной суспензии, не содержащей ГМО, в пробирку с завинчивающейся крышкой, меченную как «не содержащую ГМО», содержащую реагент для выделения ДНК. Теперь прибавьте 50 ? L образца исследуемого пищевого продукта нанесите на завинчивающуюся трубку с маркировкой "Test". Сделайте вихревыми две пробирки, содержащие образцы пищи и реагент ДНК, в течение 1 минуты. Далее поместите трубки на водяную баню при температуре 95 ? C в течение 5 мин. Наконец, поместите пробирки в центрифугу на 5 минут. При осмотре на дне трубки должна образоваться твердая гранула. Если гранула не образуется через 5 минут, снова центрифугируйте с интервалом в 2 минуты до образования гранулы. Теперь образцы можно использовать сразу для ПЦР или хранить в холодильнике до 1 недели.

Во-первых, номер шесть ПЦР-пробирок. Эти цифры будут соответствовать содержимому пробирки, указанному в таблице. Поместите каждую из промаркированных ПЦР-пробирок в держатель микропробирок с открытыми крышками.

Используя свежий совет для каждого сложения, прибавляйте 20 ? L праймера указан в таблице к каждой ПЦР-пробирке. Затем прибавьте 20 ? L образцов ДНК, указанных в Таблице, к каждой ПЦР-пробирке. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте. Для гранулированных образцов обязательно пипетируйте только из надосадочной жидкости, и избегайте твердой гранулы на дне пробирок. Наконец, поместите пробирки для ПЦР в термоамплификатор и запрограммируйте его на циклическое прохождение этапов нагрева и охлаждения, указанных в таблице.

Поместите 3% агарозный гель в камеру электрофореза так, чтобы лунки были ближе всего к концу катода. Добавьте буфер TAE в камеру так, чтобы он был на 2 мм выше лотка для геля. Соберите ПЦР-пробирки из амплификатора и поместите их в держатель микропробирок. Используя каждый раз свежий наконечник для дозатора, добавляйте 10 ? Л купленного ДНК загружают краситель в каждый образец и хорошо перемешивают.

Используя каждый раз свежий наконечник, загружайте лунки агарозного геля на 20 ? L линейки молекулярной массы в одну лунку, и 20 ? L каждой пробы в последующие скважины, как указано в данной таблице. Установите камеру электрофореза на напряжение 100 В в течение 30 мин.

Когда гель закончит работать, осторожно отключите гелевую камеру от сети, извлеките лоток и вставьте гель в лоток для окрашивания. Погрузите гель в купленное 100x гелевое пятно на 5 минут, осторожно встряхивая поднос, чтобы распределить пятно. После окрашивания переложите гель в емкость для стирки и промойте водой из-под крана в течение примерно 10 секунд. Очистите от пятен, промыв три раза в теплой воде из-под крана в течение 3 минут каждый, осторожно встряхивая для достижения наилучших результатов. При необходимости продолжайте отстаивание в теплой воде до достижения нужного контраста.

Наличие или отсутствие полосы 200 п.о. на полосе 4 указывает на то, содержит ли исследуемый продукт ГМО. Растительные праймеры определяют, была ли успешно извлечена ДНК растения из образца. Контроль пищевых продуктов без ГМО является индикатором ложноположительных результатов, если они произойдут. Если результаты проверки продуктов питания без ГМО положительные, это означает, что ПЦР был загрязнен в какой-то момент. Контроль ГМО-положительного шаблона является индикатором ложноотрицательных результатов. Если ГМО-положительный контроль матрицы не амплифицируется, возникает проблема с реакцией ПЦР и нельзя доверять ГМО-отрицательному результату тестируемой пищи.

Гели могут быть размещены на белой или желтой бумаге, чтобы создать контрастный фон для выделения полос ДНК, или повышенный контраст может быть достигнут с помощью короба ультрафиолетового излучения.

Возможность тестирования пищевых продуктов или продуктов на наличие генетически модифицированных ингредиентов имеет отношение к ряду научных или нормативных приложений.

Существуют некоторые доказательства того, что трансгенная ДНК генетически модифицированных культур может внедряться в геномы популяций диких сельскохозяйственных культур. Например, опылители могут способствовать такому переносу, удобряя растения дикого типа пыльцой из генетически модифицированного источника. Это вызывает беспокойство, поскольку влияние распространения этих вставленных генов на экосистемы в целом не совсем понятно. ПЦР-тестирование диких популяций может предоставить данные о потенциальном распространении или успешном сдерживании генетических вставок.

Отсутствие маркировки или неправильная маркировка генетически модифицированных ингредиентов может стать проблемой для потребителей. Это может быть связано с предпочтениями потребителя в потреблении или потенциальным введением аллергенов в процессе ГМ, хотя последнее является спорным. В некоторых странах генетически модифицированные ингредиенты должны быть указаны на упаковке пищевых продуктов. Регулирующие органы в таких странах могут использовать ПЦР-тестирование для проверки точности маркировки пищевых продуктов.

В тех случаях, когда генетическая модификация, вносимая в культуру, придает устойчивость к пестицидам, некоторые исследования вызывают обеспокоенность по поводу производства «супер-сорняков». По сути, это может быть любое растение, изначально не предназначенное для модификации, которое приобретает устойчивость к пестицидам с помощью таких механизмов, как интрогрессия или гибридизация. Эти растения могут распространяться более успешно, и их труднее контролировать, чем те, у которых нет вставки. ПЦР-тестирование на генетическую модификацию может помочь выявить и отследить такие потенциальные популяции, чтобы определить, может ли такое распространение оказаться проблематичным.

Вы только что посмотрели введение JoVE в тестирование ГМО-продуктов. Теперь вы должны понять принципы идентификации генетически модифицированных продуктов с помощью ПЦР, как извлекать и амплифицировать ДНК из пищи и как определить, был ли ваш образец пищи генетически модифицирован. Спасибо за просмотр!