1.6: Тестирование генетически модифицированных продуктов питания

1. Экстракция ДНК из образцов пищи

1. Добавьте 500 мкл купленной матрицы для ПЦР-микса в каждую из 2 пробирок с винтовой крышкой с помощью передаточной пипетки или 200-1 000 мкл микропипетки регулируемого объема. Пипетка вверх и вниз с пипеткой между каждой аликвотой, чтобы равномерно перемешать матрицу ПЦР.
2. Пометьте одну трубку с завинчивающейся крышкой «без ГМО», а другую «тест».
3. Отвесьте 0,5 г сертифицированного продукта без ГМО и положите его в ступку.
4. Добавьте 2,5 мл дистиллированной воды и растирайте пестиком в течение 2 минут до образования кашицы.
5. Добавьте еще 2,5 мл дистиллированной воды и продолжайте растирать пестиком, пока кашица не станет достаточно гладкой для пипетирования.
6. Пипетируйте 50 мкл измельченной суспензии в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую 500 мкл предварительного смеси ПЦР, помеченного как «без ГМО», с использованием метки 50 мкл на градуированной пипетке. Трубка с крышкой.
7. Повторите шаги 1.3–1.6 для подготовки тестового образца пищевого продукта.
8. Пипетку 50 мкл наземной тестовой пищевой суспензии нанесите на пробирку с завинчивающейся крышкой с маркировкой «test». Трубка с крышкой.
9. Проведите вихревую обработку пищевых продуктов без ГМО и проверьте пищевые ПЦР-пробирки на 1 минуту и поместите пробирки на водяную баню при температуре 95 °C на 5 минут. Если вихря нет, переведите трубку несколько раз, чтобы перемешать, прежде чем поместить на водяную баню.
10. Поместите пробирки в центрифугу на 5 минут. На дне трубки должна образоваться твердая гранула. Если гранулы не образуются через 5 минут, снова центрифугируйте с интервалом в 2 минуты до образования гранул.
11. Пробирки можно использовать сразу для ПЦР или хранить в холодильнике до 1 недели.

2. Настройка ПЦР-реакций

1. Пронумеруйте пробирки для ПЦР 1–6 и инициализируйте их. Номера должны соответствовать следующему содержимому пробирки, перечисленному в таблице Таблица 1.
2. Поместите каждую промаркированную ПЦР-пробирку в держатель микропробирок с открытыми крышками.
3. Используя свежий наконечник для каждого добавления, добавьте 20 мкл праймера, указанного в таблице Таблица 1, в каждую ПЦР-пробирку. Крышка трубок.
4. Используя свежий наконечник для каждой пробирки, добавьте 20 мкл образца ДНК, указанного в таблице Таблица 1, в каждую ПЦР-пробирку, стараясь пипетировать только из надосадочной жидкости и избегая твердой гранулы на дне пробирок.
5. После того, как каждый образец ДНК будет помещен в соответствующую ПЦР-пробирку, используйте пипетку для смешивания ДНК и праймера, осторожно пипетируя вверх и вниз; Трубки с крышкой.
6. Поместите ПЦР-пробирки в термоамплификатор и запрограммируйте его на:
   Начальное денатурирование: 1 цикл при 94 °C в течение 2 мин.
   Усиление: 40 циклов при 94 °C в течение 1 мин (денатурация), 59 °C в течение 1 мин (отжиг) и 72 °C в течение 2 мин (растяжение).
   Окончательное продление: 1 цикл при 72 °C в течение 10 мин.
   Удерживайте: 4 °C на неопределенный срок.

3. 3% препарат агарозного геля

1. С помощью лабораторного или малярного скотча надежно заклейте скотчем открытые концы лотка для геля. Убедитесь, что лента приклеена к краям лотка, чтобы предотвратить вытекание расплавленной агарозы.
2. Взвесьте 3 г агарозы в колбу Эрленмейера объемом 250 мл или больше.
3. Добавьте 100 мл 1x TAE буфера (купленного или приготовленного из концентрата).
4. С помощью магнитной конфорки с мешалкой нагрейте стакан до полного растворения агарозы в буфере, а раствор не закипит и не станет прозрачным. В качестве альтернативы можно использовать микроволновую печь, поместив стакан в духовку и нагревая с интервалом в 30 секунд, перемешивая с помощью стержня для перемешивания каждые 10 секунд, повторяя до тех пор, пока смесь не закипит и не станет прозрачной.
5. Переверните колбу Эрленмейера объемом 50 мл в отверстие колбы объемом 250 мл, чтобы она действовала как рефлегм, предотвращая испарение раствора агарозы.
6. Дайте агарозному раствору остыть до 60 °С, и налейте по 30-50 мл в каждую заклеенную гелевую ванночку.
7. Поместите гелевый гребень в первую пару выемок, чтобы создать гелевые лунки.
8. Дайте гелю полностью остыть, прежде чем снимать ленту и расчесывайте. Гель затвердеет и превратится из прозрачного в мутный, когда будет готов, примерно 10-20 минут.

4. Электрофорез продуктов ПЦР

1. Поместите готовый 3% агарозный гель на поднос для геля или используйте лоток для геля, который использовался для литья налитого 3% агарозного геля.
2. Вставьте гелевый лоток в камеру электрофореза лунками, ближайшими к катодному (черный) концу.
3. Налейте в камеру 1x буфер TAE, достаточно, чтобы буфер был 2 мм над верхней частью лотка для геля.
4. Достаньте ПЦР-пробирки из термоамплификатора и поместите в держатель микропробирок.
5. Каждый раз используя свежий наконечник для дозатора, добавьте 10 мкл приобретенного загрузочного красителя Orange G (LD) в каждый образец и хорошо перемешайте.
6. Загрузите 20 μл линейки молекулярной массы и 20 μL каждого образца в указанном порядке (Таблица 2).
7. Запустите гель-электрофорез в течение 30 минут при напряжении 100 В.
8. Извлеките лоток с гелем из камеры и сдвиньте гель, чтобы извлечь его из лотка. Поместите гель в лоток для окрашивания.
9. Погрузите гель в купленное ДНК-гелевое пятно на 5 минут, осторожно встряхивая лоток, чтобы помочь распределить пятно по всему гелю.
10. Перелейте гель в емкость для стирки и промойте водой из-под крана (40-55 °C) в течение примерно 10 с.
11. Очистите от пятен 3 раза в теплой воде из-под крана в течение 6 минут каждый раз с легким встряхиванием для достижения наилучших результатов. При необходимости продолжайте отстаивание в теплой воде до достижения нужного контраста.

Таблица 1. Список соответствующих номеров пробирок, праймеров и образцов ДНК.

Таблица 2. В соответствующем порядке необходимо загрузить в гель 20 мкл линейки с молекулярной массой и по 20 мкл каждого образца.

Генетически модифицированные продукты — это продукты, которые содержат ингредиент или ингредиенты, ДНК которых была специально изменена. Присутствие этих модификаций может быть обнаружено с помощью метода, называемого полимеразной цепной реакцией.

Генетическая модификация продуктов питания является спорным вопросом из-за спорных опасений по поводу здоровья и экологической безопасности. Возможность обнаружения генетически измененной ДНК в образцах продуктов питания, представляющих интерес, позволяет принимать обоснованные решения о безопасности и потенциальной опасности использования генетически модифицированных организмов (ГМО) в продуктах питания.

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, используется для амплификации пищевой ДНК для определения наличия или отсутствия генетически модифицированных последовательностей. Затем гель-электрофорез протягивает амплифицированную ДНК через агарозную гелевую матрицу и разделяет полосы ДНК разного размера, которые соответствуют модифицированным или немодифицированным маркерам. Затем их сравнивают с контрольными полосами из продуктов, о которых известно, что они содержат ГМО или не содержат модификаций.

В этом видео будут проиллюстрированы принципы обнаружения генетически модифицированной ДНК в образцах продуктов питания, способы извлечения ДНК и амплификации маркеров, используемых в процессе генетической модификации, а также способы установления наличия или отсутствия ГМО в образцах продуктов питания.

Полимеразная цепная реакция идентифицирует последовательности ДНК, которые были вставлены в генетически модифицированную пищу. ДНК является относительно стабильной молекулой, поэтому жизнеспособные фрагменты ДНК, пригодные для амплификации, могут быть выделены даже из продуктов с высокой степенью переработки, таких как кукурузные чипсы или овощные гамбургеры. Небольшое количество регуляторных последовательностей ДНК используется для контроля экспрессии вставленных генов, поэтому эти последовательности присутствуют в большинстве ГМ-культур. Эта процедура выявляет два наиболее часто используемых гена: ген промотора 35S и ген-терминатор нопалинсинтазы. Последовательность 35S± является сильным промотором, и при присоединении к вставленному гену будет стимулировать постоянный, высокий уровень экспрессии. Терминатор нопалинсинтазы включается для остановки транскрипции вставленного гена в желаемой конечной точке.

ПЦР включает в себя повторяющиеся циклы нагрева и охлаждения в термоамплификаторе, машине, которая строго контролирует температуру реакционных пробирок ПЦР. Нагрев образца до 94 ? С приводит к денатурации и разделению нитей ДНК. Быстрое охлаждение до 45-65 ? C позволяет праймерам отжигать на отделенных нитях ДНК. Наконец, подогрев до 72 ? C позволяет ферменту Taq-полимеразе удлинять праймеры и полностью дуплицировать целевую область.

Купленный растительный праймер добавляется к каждому образцу, и будет амплифицироваться в образцах, содержащих растительную ДНК. ГМО-положительные шаблоны для 35S и NOS используются для обеспечения положительного контроля за ГМО. Сертифицированный препарат без ГМО используется в качестве отрицательного контроля. Если какая-либо из этих контрольных реакций показывает неожиданные полосы, результатам тестовых образцов нельзя доверять.

Амплифицированная ДНК пропускается через агарозный гель с помощью электрофореза. Продукты ПЦР смешиваются с красителем и загружаются в лунки. ДНК заряжена отрицательно, и при загрузке в гель на катодном конце камеры при подаче тока она будет двигаться к анодному концу. Более крупные фрагменты ДНК не могут так легко перемещаться по гелевой матрице, поэтому остаются ближе к катоду, в то время как меньшие последовательности движутся к концу анода, что приводит к разделению ДНК разного размера на отдельные полосы.

После электрофореза окрашивание гелем помогает визуализировать разделенные полосы ДНК.

Теперь, когда мы знакомы с принципами обнаружения ГМО и использованием ПЦР и электрофореза для идентификации ГМО, давайте рассмотрим, как это можно сделать в лаборатории.

После того, как интересующие вас пищевые продукты были идентифицированы, можно приступать к анализу. Чтобы извлечь ДНК, возьмите две чистые пробирки с завинчивающейся крышкой, и в каждую из них перенесите по 500 ? L купленного реактива для выделения ДНК, обязательно пипетируя смесь вверх и вниз между аликвотами, чтобы равномерно перемешать реагент. Пометьте одну из пробирок «без ГМО», а другую «Тест».

Затем взвесьте 0,5 г сертифицированных продуктов без ГМО и поместите в чистую ступку. Добавьте 2,5 мл дистиллированной воды, и растирайте пестиком в течение 2 минут до образования кашицы. Добавьте еще 2,5 мл дистиллированной воды и продолжайте измельчать суспензию, пока она не станет достаточно гладкой для пипетки.

Пипетка 50 ? L известной суспензии, не содержащей ГМО, в пробирку с завинчивающейся крышкой, меченную как «не содержащую ГМО», содержащую реагент для выделения ДНК. Теперь прибавьте 50 ? L образца исследуемого пищевого продукта нанесите на завинчивающуюся трубку с маркировкой "Test". Сделайте вихревыми две пробирки, содержащие образцы пищи и реагент ДНК, в течение 1 минуты. Далее поместите трубки на водяную баню при температуре 95 ? C в течение 5 мин. Наконец, поместите пробирки в центрифугу на 5 минут. При осмотре на дне трубки должна образоваться твердая гранула. Если гранула не образуется через 5 минут, снова центрифугируйте с интервалом в 2 минуты до образования гранулы. Теперь образцы можно использовать сразу для ПЦР или хранить в холодильнике до 1 недели.

Во-первых, номер шесть ПЦР-пробирок. Эти цифры будут соответствовать содержимому пробирки, указанному в таблице. Поместите каждую из промаркированных ПЦР-пробирок в держатель микропробирок с открытыми крышками.

Используя свежий совет для каждого сложения, прибавляйте 20 ? L праймера указан в таблице к каждой ПЦР-пробирке. Затем прибавьте 20 ? L образцов ДНК, указанных в Таблице, к каждой ПЦР-пробирке. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте. Для гранулированных образцов обязательно пипетируйте только из надосадочной жидкости, и избегайте твердой гранулы на дне пробирок. Наконец, поместите пробирки для ПЦР в термоамплификатор и запрограммируйте его на циклическое прохождение этапов нагрева и охлаждения, указанных в таблице.

Поместите 3% агарозный гель в камеру электрофореза так, чтобы лунки были ближе всего к концу катода. Добавьте буфер TAE в камеру так, чтобы он был на 2 мм выше лотка для геля. Соберите ПЦР-пробирки из амплификатора и поместите их в держатель микропробирок. Используя каждый раз свежий наконечник для дозатора, добавляйте 10 ? Л купленного ДНК загружают краситель в каждый образец и хорошо перемешивают.

Используя каждый раз свежий наконечник, загружайте лунки агарозного геля на 20 ? L линейки молекулярной массы в одну лунку, и 20 ? L каждой пробы в последующие скважины, как указано в данной таблице. Установите камеру электрофореза на напряжение 100 В в течение 30 мин.

Когда гель закончит работать, осторожно отключите гелевую камеру от сети, извлеките лоток и вставьте гель в лоток для окрашивания. Погрузите гель в купленное 100x гелевое пятно на 5 минут, осторожно встряхивая поднос, чтобы распределить пятно. После окрашивания переложите гель в емкость для стирки и промойте водой из-под крана в течение примерно 10 секунд. Очистите от пятен, промыв три раза в теплой воде из-под крана в течение 3 минут каждый, осторожно встряхивая для достижения наилучших результатов. При необходимости продолжайте отстаивание в теплой воде до достижения нужного контраста.

Наличие или отсутствие полосы 200 п.о. на полосе 4 указывает на то, содержит ли исследуемый продукт ГМО. Растительные праймеры определяют, была ли успешно извлечена ДНК растения из образца. Контроль пищевых продуктов без ГМО является индикатором ложноположительных результатов, если они произойдут. Если результаты проверки продуктов питания без ГМО положительные, это означает, что ПЦР был загрязнен в какой-то момент. Контроль ГМО-положительного шаблона является индикатором ложноотрицательных результатов. Если ГМО-положительный контроль матрицы не амплифицируется, возникает проблема с реакцией ПЦР и нельзя доверять ГМО-отрицательному результату тестируемой пищи.

Гели могут быть размещены на белой или желтой бумаге, чтобы создать контрастный фон для выделения полос ДНК, или повышенный контраст может быть достигнут с помощью короба ультрафиолетового излучения.

Возможность тестирования пищевых продуктов или продуктов на наличие генетически модифицированных ингредиентов имеет отношение к ряду научных или нормативных приложений.

Существуют некоторые доказательства того, что трансгенная ДНК генетически модифицированных культур может внедряться в геномы популяций диких сельскохозяйственных культур. Например, опылители могут способствовать такому переносу, удобряя растения дикого типа пыльцой из генетически модифицированного источника. Это вызывает беспокойство, поскольку влияние распространения этих вставленных генов на экосистемы в целом не совсем понятно. ПЦР-тестирование диких популяций может предоставить данные о потенциальном распространении или успешном сдерживании генетических вставок.

Отсутствие маркировки или неправильная маркировка генетически модифицированных ингредиентов может стать проблемой для потребителей. Это может быть связано с предпочтениями потребителя в потреблении или потенциальным введением аллергенов в процессе ГМ, хотя последнее является спорным. В некоторых странах генетически модифицированные ингредиенты должны быть указаны на упаковке пищевых продуктов. Регулирующие органы в таких странах могут использовать ПЦР-тестирование для проверки точности маркировки пищевых продуктов.

В тех случаях, когда генетическая модификация, вносимая в культуру, придает устойчивость к пестицидам, некоторые исследования вызывают обеспокоенность по поводу производства «супер-сорняков». По сути, это может быть любое растение, изначально не предназначенное для модификации, которое приобретает устойчивость к пестицидам с помощью таких механизмов, как интрогрессия или гибридизация. Эти растения могут распространяться более успешно, и их труднее контролировать, чем те, у которых нет вставки. ПЦР-тестирование на генетическую модификацию может помочь выявить и отследить такие потенциальные популяции, чтобы определить, может ли такое распространение оказаться проблематичным.

Вы только что посмотрели введение JoVE в тестирование ГМО-продуктов. Теперь вы должны понять принципы идентификации генетически модифицированных продуктов с помощью ПЦР, как извлекать и амплифицировать ДНК из пищи и как определить, был ли ваш образец пищи генетически модифицирован. Спасибо за просмотр!