Тестирование генетически модифицированных продуктов питания

1. Экстракция ДНК из образцов пищи

1. Добавьте 500 мкл купленной матрицы для ПЦР-микса в каждую из 2 пробирок с винтовой крышкой с помощью передаточной пипетки или 200-1 000 мкл микропипетки регулируемого объема. Пипетка вверх и вниз с пипеткой между каждой аликвотой, чтобы равномерно перемешать матрицу ПЦР.
2. Пометьте одну трубку с завинчивающейся крышкой «без ГМО», а другую «тест».
3. Отвесьте 0,5 г сертифицированного продукта без ГМО и положите его в ступку.
4. Добавьте 2,5 мл дистиллированной воды и растирайте пестиком в течение 2 минут до образования кашицы.
5. Добавьте еще 2,5 мл дистиллированной воды и продолжайте растирать пестиком, пока кашица не станет достаточно гладкой для пипетирования.
6. Пипетируйте 50 мкл измельченной суспензии в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую 500 мкл предварительного смеси ПЦР, помеченного как «без ГМО», с использованием метки 50 мкл на градуированной пипетке. Трубка с крышкой.
7. Повторите шаги 1.3–1.6 для подготовки тестового образца пищевого продукта.
8. Пипетку 50 мкл наземной тестовой пищевой суспензии нанесите на пробирку с завинчивающейся крышкой с маркировкой «test». Трубка с крышкой.
9. Проведите вихревую обработку пищевых продуктов без ГМО и проверьте пищевые ПЦР-пробирки на 1 минуту и поместите пробирки на водяную баню при температуре 95 °C на 5 минут. Если вихря нет, переведите трубку несколько раз, чтобы перемешать, прежде чем поместить на водяную баню.
10. Поместите пробирки в центрифугу на 5 минут. На дне трубки должна образоваться твердая гранула. Если гранулы не образуются через 5 минут, снова центрифугируйте с интервалом в 2 минуты до образования гранул.
11. Пробирки можно использовать сразу для ПЦР или хранить в холодильнике до 1 недели.

2. Настройка ПЦР-реакций

1. Пронумеруйте пробирки для ПЦР 1–6 и инициализируйте их. Номера должны соответствовать следующему содержимому пробирки, перечисленному в таблице Таблица 1.
2. Поместите каждую промаркированную ПЦР-пробирку в держатель микропробирок с открытыми крышками.
3. Используя свежий наконечник для каждого добавления, добавьте 20 мкл праймера, указанного в таблице Таблица 1, в каждую ПЦР-пробирку. Крышка трубок.
4. Используя свежий наконечник для каждой пробирки, добавьте 20 мкл образца ДНК, указанного в таблице Таблица 1, в каждую ПЦР-пробирку, стараясь пипетировать только из надосадочной жидкости и избегая твердой гранулы на дне пробирок.
5. После того, как каждый образец ДНК будет помещен в соответствующую ПЦР-пробирку, используйте пипетку для смешивания ДНК и праймера, осторожно пипетируя вверх и вниз; Трубки с крышкой.
6. Поместите ПЦР-пробирки в термоамплификатор и запрограммируйте его на:
   Начальное денатурирование: 1 цикл при 94 °C в течение 2 мин.
   Усиление: 40 циклов при 94 °C в течение 1 мин (денатурация), 59 °C в течение 1 мин (отжиг) и 72 °C в течение 2 мин (растяжение).
   Окончательное продление: 1 цикл при 72 °C в течение 10 мин.
   Удерживайте: 4 °C на неопределенный срок.

3. 3% препарат агарозного геля

1. С помощью лабораторного или малярного скотча надежно заклейте скотчем открытые концы лотка для геля. Убедитесь, что лента приклеена к краям лотка, чтобы предотвратить вытекание расплавленной агарозы.
2. Взвесьте 3 г агарозы в колбу Эрленмейера объемом 250 мл или больше.
3. Добавьте 100 мл 1x TAE буфера (купленного или приготовленного из концентрата).
4. С помощью магнитной конфорки с мешалкой нагрейте стакан до полного растворения агарозы в буфере, а раствор не закипит и не станет прозрачным. В качестве альтернативы можно использовать микроволновую печь, поместив стакан в духовку и нагревая с интервалом в 30 секунд, перемешивая с помощью стержня для перемешивания каждые 10 секунд, повторяя до тех пор, пока смесь не закипит и не станет прозрачной.
5. Переверните колбу Эрленмейера объемом 50 мл в отверстие колбы объемом 250 мл, чтобы она действовала как рефлегм, предотвращая испарение раствора агарозы.
6. Дайте агарозному раствору остыть до 60 °С, и налейте по 30-50 мл в каждую заклеенную гелевую ванночку.
7. Поместите гелевый гребень в первую пару выемок, чтобы создать гелевые лунки.
8. Дайте гелю полностью остыть, прежде чем снимать ленту и расчесывайте. Гель затвердеет и превратится из прозрачного в мутный, когда будет готов, примерно 10-20 минут.

4. Электрофорез продуктов ПЦР

1. Поместите готовый 3% агарозный гель на поднос для геля или используйте лоток для геля, который использовался для литья налитого 3% агарозного геля.
2. Вставьте гелевый лоток в камеру электрофореза лунками, ближайшими к катодному (черный) концу.
3. Налейте в камеру 1x буфер TAE, достаточно, чтобы буфер был 2 мм над верхней частью лотка для геля.
4. Достаньте ПЦР-пробирки из термоамплификатора и поместите в держатель микропробирок.
5. Каждый раз используя свежий наконечник для дозатора, добавьте 10 мкл приобретенного загрузочного красителя Orange G (LD) в каждый образец и хорошо перемешайте.
6. Загрузите 20 μл линейки молекулярной массы и 20 μL каждого образца в указанном порядке (Таблица 2).
7. Запустите гель-электрофорез в течение 30 минут при напряжении 100 В.
8. Извлеките лоток с гелем из камеры и сдвиньте гель, чтобы извлечь его из лотка. Поместите гель в лоток для окрашивания.
9. Погрузите гель в купленное ДНК-гелевое пятно на 5 минут, осторожно встряхивая лоток, чтобы помочь распределить пятно по всему гелю.
10. Перелейте гель в емкость для стирки и промойте водой из-под крана (40-55 °C) в течение примерно 10 с.
11. Очистите от пятен 3 раза в теплой воде из-под крана в течение 6 минут каждый раз с легким встряхиванием для достижения наилучших результатов. При необходимости продолжайте отстаивание в теплой воде до достижения нужного контраста.

Номер трубки	Грунтовка	Образец ДНК
1	20 μL Грунтовка для растений (зеленая)	20 мкл ДНК контроля пищевых продуктов без ГМО
2	20 мкл праймера ГМО (красный)	20 мкл ДНК контроля пищевых продуктов без ГМО
3	20 μL Грунтовка для растений (зеленая)	20 μL Тестовая пищевая ДНК
4	20 мкл праймера ГМО (красная)	20 μL Тестовая пищевая ДНК
5	20 μL Грунтовка для растений (зеленая)	20 мкл ГМО положительная контрольная ДНК
6	20 мкл праймера ГМО (красный)	20 μL ГМО положительная контрольная ДНК

Таблица 1. Список соответствующих номеров пробирок, праймеров и образцов ДНК.

Ну 1	Образец 1 Контроль пищевых продуктов без ГМО с растительными праймерами 20 μл.
Ну 2	Образец 2 Контроль пищевых продуктов без ГМО с праймерами 20 μл.
Ну 3	Образец 3 Тестовый корм с растительными праймерами 20 μл.
Ну 4	Образец 4 Тестовый корм с праймерами ГМО 20 μл.
Ну 5	Образец 5 ГМО-положительной ДНК с растительными праймерами 20 μл.
Ну 6	Образец 6 ГМО-положительной ДНК с ГМО-праймерами 20 μл.
Ну 7	Линейка молекулярной массы ПЦР 20 μл.
Ну 8	Оставьте пустым.

Таблица 2. В соответствующем порядке необходимо загрузить в гель 20 мкл линейки с молекулярной массой и по 20 мкл каждого образца.