Визуализация почвенных микроорганизмов с помощью контактного предметного стекла и микроскопии

1. Подготовка почвенного микрокосма

1. Соберите садовую землю с поверхности (глубиной 0-6 дюймов) и взвесьте 150 г почвы в две отдельные чашки.
   1. Если почва имеет высокую плотность органического вещества, весят 100 г.
2. Подпишите одну чашку «Лечение», а другую «Контроль».
3. Рассчитайте количество воды, необходимое для изменения содержания влаги.
   1. Содержание влаги часто близко к производительности поля.
      
4. Отмерьте количество дистиллированной воды с помощью мерного цилиндра.
5. Разлейте количество дистиллированной воды в два флакона.
6. Пометьте один флакон «Лечение», а другой — «Контроль».
7. Добавьте в воду во флаконе «Обработка» достаточное количество глюкозы для достижения конечной концентрации глюкозы в почве 1% в пересчете на сухую массу в почве «Обработка».
8. Добавьте 200 мг NH₄NO₃ во флакон «Лечение» и перемешайте, чтобы растворить добавки. Селитра служит азотным источником питательных веществ для почвенных микробов.
9. Не вносите изменения во флакон «Контроль».
10. В небольших аликвотах примерно по 50 мг смешайте содержимое флакона «Лечение» в чашке «Лечение». Перемешивайте лопаткой после каждого добавления аликвоты.
11. В небольших аликвотах смешайте содержимое флакона «Контроль» с чашкой «Контроль». Перемешивайте лопаткой после каждого добавления аликвоты.
12. Пометьте четыре чистых предметных стекла микроскопа: два предметных стекла «Лечение» и два предметных стекла «Контроль».
13. Вставьте два предметных стекла "Treatment" в стаканчик для грунта "Treatment", а два предметных стекла "Control" - в стакан для грунта "Control". Оставьте 2 см каждой горки выступающей над поверхностью почвы, и обязательно оставьте зазор между двумя горками.
14. Накройте стаканчики полиэтиленовой пленкой и закрепите ее резинкой.
15. Проколите пленку несколько раз, чтобы пустить воздух, но при этом предотвратить чрезмерное испарение.
16. Запишите вес обеих чашек.
17. Инкубируйте наполненные почвой стаканчики при комнатной температуре в специально отведенном месте/инкубаторе в течение 7 дней.

2. Окрашивание предметными стеклами и микроскопия

1. Запишите вес обеих чашек.
2. Рассчитайте влажность почвы в момент снятия горки.
3. Снимите два предметных стекла с каждой чашки, нажимая на каждый предметный стекал в наклонное положение и вынимая его так, чтобы верхняя поверхность предметного стекла не была нарушена.
4. Определите и отметьте сторону предметного стекла, которую нужно испачкать и наблюдать.
5. Аккуратно постукивайте по горкам на столешнице, чтобы удалить крупные частицы почвы.
6. С помощью влажного бумажного полотенца очистите нижнюю поверхность слайдов. Просушите горки при комнатной температуре.
7. Надев защитные очки и удерживая каждое предметное стекло щипцами, погрузите предметные стекла в 40% (v/v) уксусную кислоту на 1-3 минуты под вытяжной шкаф.
8. Смойте излишки кислоты под слабой струей воды.
9. С помощью флакона-капельницы накройте поверхность предметных колец фенольной бенгальской розой. Установите предметное стекло на решетку для окрашивания над контейнером, чтобы собрать излишки пятна. Будьте осторожны, не мойте с силой, которая может удалить микроорганизмы с поверхности горки.
10. Окрашивайте предметные стекла в течение 5-10 мин. Не допускайте высыхания предметного стекла. При необходимости добавьте еще морилку.
11. Аккуратно промойте слайды, чтобы удалить излишки пятна.
12. Дайте горкам высохнуть при комнатной температуре.
13. Используя масляный иммерсионный объектив, понаблюдайте за предметным стеклом с помощью микроскопа (рис. 1).

Рисунок 1. Предметное стекло под микроскопом.