3.10: Ультразвуковая экстракция липидных биомаркеров из отложений

1. Соберите необходимые материалы

1. Образцы (листья, грязь, грибы, кора, ткани), обычно замороженные, сублимационные, измельченные и гомогенизированные перед экстракцией, извлекаются группами для достижения максимальной эффективности. Извлеките три образца.
2. В зависимости от размера образца могут использоваться флаконы объемом от 4 до 60 мл. Для этого эксперимента используются флаконы из боросиликатного стекла (40 мл) и безопасные для растворителей колпачки. Флаконы, пипетки из боросиликатного стекла и банки для взвешивания следует сжигать при температуре 550 °C в течение 6 ч перед тем, как обеспечить удаление возможных органических загрязнений.
3. Дихлорметан и метанол широко распространены в большинстве лабораторий органической геохимии. Они используются по отдельности для ополаскивания лабораторных инструментов и стеклянной посуды перед использованием. Смесь дихлорметана (DCM) и метанола (MeOH; 9:1) используется во многих лабораториях для эффективного извлечения биомаркеров с широким диапазоном полярностей. Растворители не должны содержать органических загрязнителей.
4. Используйте гидроакустическую баню комнатной температуры. Ультразвуковые аппараты различных размеров и ультразвука с нагревом или без него доступны в крупных розничных магазинах научного оборудования.
5. Штативы для флаконов, которые должны быть водонепроницаемыми, будут помещены в ванну с ультразвуком.
6. Вытяжка для химикатов, одобренная растворителем.

2. Подготовка образца

1. Положите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и держите в таре.
2. Промойте лабораторный шпатель растворителем, затем используйте его для переноса соответствующей массы образца в банку для взвешивания и запишите массу.
   1. Масса образца варьируется в зависимости от содержания в нем органического вещества. Для относительно органического материала (морская грязь) может потребоваться несколько граммов, в то время как для материала, богатого органическим веществом (ткань листьев), может потребоваться гораздо меньше.
3. Переложите весь материал из весовой банки в сгоревшую, предварительно взвешенную и маркированную пробирку. Закройте флакон крышкой, затем выбросьте форму для взвешивания.
4. Выполните шаги 2.1 - 2.3 для каждого извлекаемого образца.

3. Извлечение

1. С помощью предварительно сгоревшей пипетки и лампы перелейте ~20 мл смеси DCM:MeOH (9:1) в каждый флакон (флакон должен быть заполнен примерно наполовину). Закройте флаконы перед тем, как перейти к следующему образцу, чтобы летучие растворители не испарились.
   1. Летучесть DCM и MeOH различна. Испарение экстракционного растворителя за счет неукупоренных пробирок с пробой имеет возможность изменять свою полярность, а значит и экстракцию.
2. Поместите флаконы с образцами в водонепроницаемый штатив для флаконов.
3. Убедитесь, что уровень воды в ультразвуковой ванне достаточен только для погружения пробирок с образцами до верха экстракционного растворителя. Слишком большое количество воды может привести к тому, что флаконы всплывут; Слишком малое количество воды может помешать правильному перемешиванию образцов.
4. Поместите штатив для флаконов с находящимися в нем образцами прямо в ванну с ультразвуком.
5. Ультразвуком в течение 30 минут при комнатной температуре.
6. Снимите штатив для образцов с ультразвукового аппарата. При извлечении отложений дайте ему постоять в течение 30 минут, чтобы произошло оседание. Если вы извлекаете еще один набор образцов, поместите в это время ультразвуковую терапию.
7. Извлеките смесь DCM:MeOH из флакона для экстракции с помощью предварительно сгоревшей пипетки и лампы и вставьте в другой предварительно взвешенный, предварительно сгоревший и маркированный флакон объемом 40 мл.
8. Повторите 3,1 - 3,7 3 раза для всех образцов.
9. Дайте извлеченным образцам высохнуть во флаконах, сняв крышки, и в колпаке, неплотно накрытом куском фольги. Пометьте как «извлеченный остаток» и храните.
10. Обозначьте объединенные экстракты для каждого образца как «TLE».

Первым шагом в палеоклиматологии является сбор или извлечение биомаркеров из отложений, в которых они находятся. Образцы окружающей среды состоят из неорганических компонентов, таких как минералы, вода и металлы, а также органических компонентов, которые создаются живыми организмами в этом районе. Прежде чем эти органические компоненты могут быть использованы учеными для прояснения информации о прошлом, они должны быть удалены из окружающей среды. Ультразвуковая обработка, в которой используются ультразвуковые волны, является самым простым и наименее дорогим из этих методов.

Это видео является частью серии статей об экстракции, очистке и анализе липидов из отложений. Он проиллюстрирует экстракцию липидов с помощью ультразвука и представит несколько применений метода.

Из-за широкого спектра биомаркеров не существует единого растворителя, оптимизированного для экстракции всех из них. Это обобщено так называемым правилом «подобное растворяется подобным», в соответствии с которым относительно аполярные молекулы растворяются в аполярных растворителях, таких как дихлорметан, а более полярные молекулы растворяются в более полярных растворителях, таких как метанол. Смеси растворителей для экстракции конкретных липидов или групп липидов обычно оптимизируются эмпирически.

Для ускорения экстракции и увеличения выхода используется ультразвуковая система подачи ультразвука – волн с частотами более 20 кГц, совместно с смесью растворителей. Когда эти волны контактируют с жидкой органической фазой, они вызывают образование короткоживущих микропузырьков паров растворителя, которые быстро растут и схлопываются. При схлопывании эти пузырьки высвобождают огромное количество энергии в виде механического сдвига, способствуя солюбилизации липидов и значительно повышая эффективность экстракции.

После процесса экстракции растворителем с помощью ультразвука в результате получается сырой препарат экстракта, называемый общим липидным экстрактом, который подвергается дальнейшей очистке для качественного и количественного исследования липидных сигнатур. Теперь, когда вы понимаете некоторые из основных принципов экстракции липидов с помощью ультразвуковой обработки, давайте рассмотрим протокол проведения процедуры.

Соберите необходимые образцы материалов из выбранного места. В качестве примера можно привести озерные и морские отложения, наземные почвы, микробные культуры или листья растений. Собранный материал замораживают на ночь. После этого его лиофилизируют в сублимационной сушилке в течение 2-3 дней. Измельчите и гомогенизируйте лиофилизированные образцы перед экстракцией с помощью промытой растворителем ступки и пестика. Чтобы удалить органические загрязнения, сожгите необходимые пипетки из боросиликатного стекла, флаконы и банки для взвешивания в духовке. Дав стеклянной посуде остыть в духовке, промойте металлические инструменты смесью дихлорметана и метанола. После того, как образец и стеклянная посуда подготовлены, можно приступать к процедуре ультразвуковой обработки.

С этого момента все емкости и стеклянная посуда должны быть сгореть перед использованием. Поместите форму для взвешивания на весы и тару. Промойте лабораторный шпатель смесью растворителей, затем используйте его для переноса соответствующей массы лиофилизированного, гомогенизированного образца в форму для взвешивания и запишите массу. Осторожно переложите взвешенный образец в промаркированный флакон. Используя флакон с распылением DCM:MeOH, добавьте достаточно, чтобы образец был покрыт 1-2 см растворителя, и закройте флакон крышкой. Поместите флакон на водонепроницаемую решетку, теперь она готова к ультразвуковой обработке. Поместите штатив прямо в ванну с ультразвуком. Убедитесь, что уровень воды в ультразвуковой ванне достаточно низок для погружения пробирок с образцами до верха экстракционного растворителя. Обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут при комнатной температуре. После обработки ультразвуком снимите стойку с ультразвуковой обработки. Дайте флаконам постоять, чтобы осадок оседал.

Удалите верхнюю фазу дихлорметана-метанола из экстракционного флакона с помощью пипетки и колбы и переложите в другой предварительно взвешенный и маркированный флакон. Повторите процесс обработки ультразвуком в общей сложности три раза для каждого образца. Соберите экстракты в один флакон. Дайте извлеченным образцам высохнуть во флаконах, сняв крышки, и в колпаке, неплотно накрытом куском фольги. Пометьте как «экстрагированный остаток» и храните в экстракционном растворителе. Теперь, когда биомаркеры были извлечены, они должны быть очищены перед проведением анализа.

Ультразвуковая обработка ускоряет несколько процессов экстракции растворителем и широко используется в геохимических исследованиях. Многие археологи работают с геохимиками для того, чтобы реконструировать экологические и культурные условия, в которых жили ранние человеческие цивилизации. Керамика, одно из старейших изобретений человека, при обнаружении может содержать остаточные молекулярные окаменелости от вина, риса или другого содержимого, которое когда-то хранилось внутри.

Чтобы обнаружить химические доказательства абсорбции веществ на поверхности, небольшие образцы керамики обрабатывают ультразвуком в присутствии органических растворителей, а экстрагированные соединения могут быть впоследствии идентифицированы с помощью спектроскопических методов. Такой анализ помогает археологам выявить виды ресурсов, которые были доступны древним популяциям, и реконструировать условия их обитания.

Фотосинтезирующие микроводоросли встречаются в морских и пресноводных экосистемах. Поскольку они произрастают в средах на основе морской воды, а их культура занимает значительно меньшие площади, в настоящее время они широко изучаются как перспективная альтернатива наземным растениям для производства биотоплива.

Чтобы извлечь липиды из биомассы микроводорослей, эти исследователи описывают экстракцию растворителем с помощью ультразвука. Акустическая кавитация во время ультразвуковой обработки эффективно разрушает жесткие клеточные стенки микроводорослей с целью высвобождения липидов. Такие методы помогают охарактеризовать новые микроводоросли из окружающей среды для производства ненефтяных источников энергии.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию биомаркеров из отложений с помощью ультразвуковой обработки. В следующих видеороликах объясняется, как происходит дальнейшая очистка экстракта для анализа.

Спасибо за просмотр!