Ультразвуковая экстракция липидных биомаркеров из отложений

Первым шагом в палеоклиматологии является сбор или извлечение биомаркеров из отложений, в которых они находятся. Образцы окружающей среды состоят из неорганических компонентов, таких как минералы, вода и металлы, а также органических компонентов, которые создаются живыми организмами в этом районе. Прежде чем эти органические компоненты могут быть использованы учеными для прояснения информации о прошлом, они должны быть удалены из окружающей среды. Ультразвуковая обработка, в которой используются ультразвуковые волны, является самым простым и наименее дорогим из этих методов.

Это видео является частью серии статей об экстракции, очистке и анализе липидов из отложений. Он проиллюстрирует экстракцию липидов с помощью ультразвука и представит несколько применений метода.

Из-за широкого спектра биомаркеров не существует единого растворителя, оптимизированного для экстракции всех из них. Это обобщено так называемым правилом «подобное растворяется подобным», в соответствии с которым относительно аполярные молекулы растворяются в аполярных растворителях, таких как дихлорметан, а более полярные молекулы растворяются в более полярных растворителях, таких как метанол. Смеси растворителей для экстракции конкретных липидов или групп липидов обычно оптимизируются эмпирически.

Для ускорения экстракции и увеличения выхода используется ультразвуковая система подачи ультразвука – волн с частотами более 20 кГц, совместно с смесью растворителей. Когда эти волны контактируют с жидкой органической фазой, они вызывают образование короткоживущих микропузырьков паров растворителя, которые быстро растут и схлопываются. При схлопывании эти пузырьки высвобождают огромное количество энергии в виде механического сдвига, способствуя солюбилизации липидов и значительно повышая эффективность экстракции.

После процесса экстракции растворителем с помощью ультразвука в результате получается сырой препарат экстракта, называемый общим липидным экстрактом, который подвергается дальнейшей очистке для качественного и количественного исследования липидных сигнатур. Теперь, когда вы понимаете некоторые из основных принципов экстракции липидов с помощью ультразвуковой обработки, давайте рассмотрим протокол проведения процедуры.

Соберите необходимые образцы материалов из выбранного места. В качестве примера можно привести озерные и морские отложения, наземные почвы, микробные культуры или листья растений. Собранный материал замораживают на ночь. После этого его лиофилизируют в сублимационной сушилке в течение 2-3 дней. Измельчите и гомогенизируйте лиофилизированные образцы перед экстракцией с помощью промытой растворителем ступки и пестика. Чтобы удалить органические загрязнения, сожгите необходимые пипетки из боросиликатного стекла, флаконы и банки для взвешивания в духовке. Дав стеклянной посуде остыть в духовке, промойте металлические инструменты смесью дихлорметана и метанола. После того, как образец и стеклянная посуда подготовлены, можно приступать к процедуре ультразвуковой обработки.

С этого момента все емкости и стеклянная посуда должны быть сгореть перед использованием. Поместите форму для взвешивания на весы и тару. Промойте лабораторный шпатель смесью растворителей, затем используйте его для переноса соответствующей массы лиофилизированного, гомогенизированного образца в форму для взвешивания и запишите массу. Осторожно переложите взвешенный образец в промаркированный флакон. Используя флакон с распылением DCM:MeOH, добавьте достаточно, чтобы образец был покрыт 1-2 см растворителя, и закройте флакон крышкой. Поместите флакон на водонепроницаемую решетку, теперь она готова к ультразвуковой обработке. Поместите штатив прямо в ванну с ультразвуком. Убедитесь, что уровень воды в ультразвуковой ванне достаточно низок для погружения пробирок с образцами до верха экстракционного растворителя. Обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут при комнатной температуре. После обработки ультразвуком снимите стойку с ультразвуковой обработки. Дайте флаконам постоять, чтобы осадок оседал.

Удалите верхнюю фазу дихлорметана-метанола из экстракционного флакона с помощью пипетки и колбы и переложите в другой предварительно взвешенный и маркированный флакон. Повторите процесс обработки ультразвуком в общей сложности три раза для каждого образца. Соберите экстракты в один флакон. Дайте извлеченным образцам высохнуть во флаконах, сняв крышки, и в колпаке, неплотно накрытом куском фольги. Пометьте как «экстрагированный остаток» и храните в экстракционном растворителе. Теперь, когда биомаркеры были извлечены, они должны быть очищены перед проведением анализа.

Ультразвуковая обработка ускоряет несколько процессов экстракции растворителем и широко используется в геохимических исследованиях. Многие археологи работают с геохимиками для того, чтобы реконструировать экологические и культурные условия, в которых жили ранние человеческие цивилизации. Керамика, одно из старейших изобретений человека, при обнаружении может содержать остаточные молекулярные окаменелости от вина, риса или другого содержимого, которое когда-то хранилось внутри.

Чтобы обнаружить химические доказательства абсорбции веществ на поверхности, небольшие образцы керамики обрабатывают ультразвуком в присутствии органических растворителей, а экстрагированные соединения могут быть впоследствии идентифицированы с помощью спектроскопических методов. Такой анализ помогает археологам выявить виды ресурсов, которые были доступны древним популяциям, и реконструировать условия их обитания.

Фотосинтезирующие микроводоросли встречаются в морских и пресноводных экосистемах. Поскольку они произрастают в средах на основе морской воды, а их культура занимает значительно меньшие площади, в настоящее время они широко изучаются как перспективная альтернатива наземным растениям для производства биотоплива.

Чтобы извлечь липиды из биомассы микроводорослей, эти исследователи описывают экстракцию растворителем с помощью ультразвука. Акустическая кавитация во время ультразвуковой обработки эффективно разрушает жесткие клеточные стенки микроводорослей с целью высвобождения липидов. Такие методы помогают охарактеризовать новые микроводоросли из окружающей среды для производства ненефтяных источников энергии.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию биомаркеров из отложений с помощью ультразвуковой обработки. В следующих видеороликах объясняется, как происходит дальнейшая очистка экстракта для анализа.

Спасибо за просмотр!