Культивирование и подсчет бактерий из образцов почвы

1. Приготовление разбавлений почвы

1. Чтобы начать процедуру, взвесьте 10 г образца почвы и добавьте к 95 мл деионизированной воды. Хорошенько встряхните подвеску, и наклейте на нее маркировку «А».
2. До того, как почва осядет, удалите 1 мл суспензии стерильной пипеткой и переложите ее в деионизированную водную заготовку объемом 9 мл. Тщательно обработайте вихрь, и обозначьте как «В».
3. Повторите этот этап разбавления три раза, каждый раз с 1 мл предыдущей суспензии и деионизированной водой объемом 9 мл. Обозначьте их последовательно как трубки C, D и E. Это приводит к серийному разведению от ^10-1 до ^10-5 граммов почвы на мл

2. Изготовление раскладных тарелок для бактериальной культуры

1. Чтобы вырастить колонии бактерий, возьмите три заранее подготовленные пептонно-дрожжевые агаровые пластины и пометьте их как C, D и E. Образцы Vortex C, D и E и нанесите пипеткой 0,1 мл на каждую пластину. Это еще больше увеличивает величину разбавления в десять раз (C = ^10-3, D = ^10-4, E = ^10-5).
2. Далее опустите стеклянный разбрасыватель в этанол. Поместите разбрасыватель в пламя на несколько секунд, чтобы разжечь и сжечь этанол. Это позволит простерилизовать разбрасыватель.
3. Держите разбрасыватель над первой пластиной, пока пламя не погаснет. Быстро откройте тарелку, прижав к себе крышку. Приложите разбрасыватель к агару в сторону от инокулюма (Инокулюм = клетки, используемые для начала культуры) для остывания, а затем распределите каплю инокулюма по поверхности агара до тех пор, пока следы свободной жидкости не исчезнут. Установите на место крышку тарелки.
4. Повторно разожгите разбрасыватель и повторите процесс со следующей пластиной, работая быстро, чтобы не загрязнить агар переносимыми по воздуху организмами
5. Инкубируйте бактериальные пластины при комнатной температуре в течение 1 недели. Во время инкубации убедитесь, что пластины перевернуты, чтобы капли влаги от конденсата не попадали на поверхность агара.

3. Изготовление раскладных тарелок для актиномицетов

1. Чтобы вырастить актиномицеты, возьмите три заранее приготовленные глицерин-казеиновые пластины и пометьте их как B, C и D. Используя методы, показанные ранее, распределите планшет на 0,1 мл из суспензий B, C и D. Более низкие разведения используются потому, что актиномицеты обычно присутствуют в 1/10 бактериальной популяции (B = ^10-2, C = ^10-3, D = ^10-4).
2. Инкубировать пластинки с актиномицетами (перевернутыми) при комнатной температуре в течение 2 недель.

4. Количество бактерий и актиномицетов

1. После инкубации внимательно осмотрите все бактериальные пластины и обратите внимание на различия в размере и форме колонии. При выращивании на агаре бактерии образуют слизистые колонии от бесцветных до ярко-оранжевых, желтых или розовых. Напротив, колонии актиномицетов меловые, твердые, кожистые и ломаются под давлением, где другие колонии бактерий размазываются. Это позволяет отличить колонии на ощупь с помощью стерильной петли.
2. Подсчитайте и запишите количество колоний бактерий, включая любые актиномицеты. Учитывайте только тарелки с 30-200 колониями на тарелке.

5. Изоляция чистых культур

1. Выберите отдельные колонии бактерий с любой из пластин. Можно выбрать больше колоний, если есть особый интерес к почве. Используйте планшет с высоким содержанием разбавления, так как он, как правило, имеет чистые колонии, которые хорошо отделяются. Выбирайте только те колонии, которые хорошо отделены от соседних колоний и выглядят морфологически отличными друг от друга.
2. Простерилизуйте петлю, окунув ее в спирт и обжег. Быстро откройте интересующую вас чашку Петри и прикоснитесь петлей к голому месту в агаре, чтобы охладить его. Затем удалите небольшое количество интересующей колонии на петлю.
3. Взяв свежую пептонно-дрожжевую пластину, сделайте прожилку длиной в несколько сантиметров с одной стороны. Простерилизуйте и снова остудите, затем сделайте полосу, которая пересекает начальную полосу только на первом проходе. Повторите этот процесс еще дважды таким же образом. Это полосатое «разбавление» приводит к тому, что клетки в петле отделяются друг от друга. Поместите тарелку в темное место для инкубации при комнатной температуре в течение двух недель.