Why is dilution necessary when culturing bacteria from soil samples?

Soil typically contains over one million bacteria per gram, making direct plating impossible for accurate colony counting. Serial dilutions reduce bacterial concentration to levels where individual colonies can grow separately on media plates, enabling accurate enumeration and calculation of the original bacterial population in the soil sample.

What is the difference between bacteria and actinomycetes in soil?

Actinomycetes are filamentous bacteria that grow strung together to form hyphae, distinguishing them from typical bacteria. They account for approximately 10% of the total bacterial population in soil and preferentially grow on glycerol-casein based plates, whereas most bacteria grow on peptone-yeast agar plates.

How do you prepare serial dilutions of a soil sample for bacterial enumeration?

Weigh 10 grams of soil and add to 95 milliliters of deionized water, then shake well. Transfer 1 milliliter to 9 milliliters of fresh water and vortex. Repeat this process four times sequentially, creating dilutions from 10-1 through 10-5 grams of soil per milliliter, ensuring the soil does not settle between transfers.

What colony characteristics distinguish actinomycetes from other bacteria on agar plates?

Actinomycete colonies appear chalky, firm, and leathery, breaking under pressure when touched with a sterile loop. In contrast, typical bacterial colonies are slimy and range from colorless to bright orange, yellow, or pink, smearing when touched. These tactile differences allow easy distinction between colony types.

How is the colony forming unit count calculated from dilution plates?

Multiply the number of colonies counted on the plate by the reciprocal of the dilution factor. For example, 46 colonies on a 10-5 dilution plate with 0.1 milliliter inoculant equals 46 million CFUs per gram of soil. Only count plates containing 30-200 colonies for accuracy.

What do bacterial counts reveal about soil health?

Healthy soil contains between 10-6 and 10-8 bacteria per gram. Counts below 10-6 or above 10-8 indicate unhealthy soil, potentially caused by nutrient deficiency, organic matter loss, extreme pH, or contamination. Bacterial enumeration serves as a key indicator for assessing soil ecosystem health and quality.

How can isolated soil bacteria be used to identify antibiotic compounds?

Test bacteria or compounds are added to plates containing bacterial lawns, and growth inhibition is observed. Clear patches where growth was inhibited may indicate antibiotic activity. This method allows scientists to screen isolated soil bacteria for potential new antibiotic compounds with medical applications.

Культивирование и подсчет бактерий из образцов почвы

0 просмотров10:57 мин

1. Приготовление разбавлений почвы

Чтобы начать процедуру, взвесьте 10 г образца почвы и добавьте к 95 мл деионизированной воды. Хорошенько встряхните подвеску, и наклейте на нее маркировку «А».
До того, как почва осядет, удалите 1 мл суспензии стерильной пипеткой и переложите ее в деионизированную водную заготовку объемом 9 мл. Тщательно обработайте вихрь, и обозначьте как «В».
Повторите этот этап разбавления три раза, каждый раз с 1 мл предыдущей суспензии и деионизированной водой объемом 9 мл. Обозначьте их последовательно как трубки C, D и E. Это приводит к серийному разведению от ^10-1 до ^10-5 граммов почвы на мл

2. Изготовление раскладных тарелок для бактериальной культуры

Чтобы вырастить колонии бактерий, возьмите три заранее подготовленные пептонно-дрожжевые агаровые пластины и пометьте их как C, D и E. Образцы Vortex C, D и E и нанесите пипеткой 0,1 мл на каждую пластину. Это еще больше увеличивает величину разбавления в десять раз (C = ^10-3, D = ^10-4, E = ^10-5).
Далее опустите стеклянный разбрасыватель в этанол. Поместите разбрасыватель в пламя на несколько секунд, чтобы разжечь и сжечь этанол. Это позволит простерилизовать разбрасыватель.
Держите разбрасыватель над первой пластиной, пока пламя не погаснет. Быстро откройте тарелку, прижав к себе крышку. Приложите разбрасыватель к агару в сторону от инокулюма (Инокулюм = клетки, используемые для начала культуры) для остывания, а затем распределите каплю инокулюма по поверхности агара до тех пор, пока следы свободной жидкости не исчезнут. Установите на место крышку тарелки.
Повторно разожгите разбрасыватель и повторите процесс со следующей пластиной, работая быстро, чтобы не загрязнить агар переносимыми по воздуху организмами
Инкубируйте бактериальные пластины при комнатной температуре в течение 1 недели. Во время инкубации убедитесь, что пластины перевернуты, чтобы капли влаги от конденсата не попадали на поверхность агара.

3. Изготовление раскладных тарелок для актиномицетов

Чтобы вырастить актиномицеты, возьмите три заранее приготовленные глицерин-казеиновые пластины и пометьте их как B, C и D. Используя методы, показанные ранее, распределите планшет на 0,1 мл из суспензий B, C и D. Более низкие разведения используются потому, что актиномицеты обычно присутствуют в 1/10 бактериальной популяции (B = ^10-2, C = ^10-3, D = ^10-4).
Инкубировать пластинки с актиномицетами (перевернутыми) при комнатной температуре в течение 2 недель.

4. Количество бактерий и актиномицетов

После инкубации внимательно осмотрите все бактериальные пластины и обратите внимание на различия в размере и форме колонии. При выращивании на агаре бактерии образуют слизистые колонии от бесцветных до ярко-оранжевых, желтых или розовых. Напротив, колонии актиномицетов меловые, твердые, кожистые и ломаются под давлением, где другие колонии бактерий размазываются. Это позволяет отличить колонии на ощупь с помощью стерильной петли.
Подсчитайте и запишите количество колоний бактерий, включая любые актиномицеты. Учитывайте только тарелки с 30-200 колониями на тарелке.

5. Изоляция чистых культур

Выберите отдельные колонии бактерий с любой из пластин. Можно выбрать больше колоний, если есть особый интерес к почве. Используйте планшет с высоким содержанием разбавления, так как он, как правило, имеет чистые колонии, которые хорошо отделяются. Выбирайте только те колонии, которые хорошо отделены от соседних колоний и выглядят морфологически отличными друг от друга.
Простерилизуйте петлю, окунув ее в спирт и обжег. Быстро откройте интересующую вас чашку Петри и прикоснитесь петлей к голому месту в агаре, чтобы охладить его. Затем удалите небольшое количество интересующей колонии на петлю.
Взяв свежую пептонно-дрожжевую пластину, сделайте прожилку длиной в несколько сантиметров с одной стороны. Простерилизуйте и снова остудите, затем сделайте полосу, которая пересекает начальную полосу только на первом проходе. Повторите этот процесс еще дважды таким же образом. Это полосатое «разбавление» приводит к тому, что клетки в петле отделяются друг от друга. Поместите тарелку в темное место для инкубации при комнатной температуре в течение двух недель.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Лаборатории доктора Яна Пеппера и доктора Чарльза Герба - Университет Аризоны
Демонстрирующие авторы: Брэдли Шмитц и Луиза Икнер

Поверхностн…