Культивирование и подсчет бактерий из образцов почвы
1. Приготовление разбавлений почвы
- Чтобы начать процедуру, взвесьте 10 г образца почвы и добавьте к 95 мл деионизированной воды. Хорошенько встряхните подвеску, и наклейте на нее маркировку «А».
- До того, как почва осядет, удалите 1 мл суспензии стерильной пипеткой и переложите ее в деионизированную водную заготовку объемом 9 мл. Тщательно обработайте вихрь, и обозначьте как «В».
- Повторите этот этап разбавления три раза, каждый раз с 1 мл предыдущей суспензии и деионизированной водой объемом 9 мл. Обозначьте их последовательно как трубки C, D и E. Это приводит к серийному разведению от 10-1 до 10-5 граммов почвы на мл
2. Изготовление раскладных тарелок для бактериальной культуры
- Чтобы вырастить колонии бактерий, возьмите три заранее подготовленные пептонно-дрожжевые агаровые пластины и пометьте их как C, D и E. Образцы Vortex C, D и E и нанесите пипеткой 0,1 мл на каждую пластину. Это еще больше увеличивает величину разбавления в десять раз (C = 10-3, D = 10-4, E = 10-5).
- Далее опустите стеклянный разбрасыватель в этанол. Поместите разбрасыватель в пламя на несколько секунд, чтобы разжечь и сжечь этанол. Это позволит простерилизовать разбрасыватель.
- Держите разбрасыватель над первой пластиной, пока пламя не погаснет. Быстро откройте тарелку, прижав к себе крышку. Приложите разбрасыватель к агару в сторону от инокулюма (Инокулюм = клетки, используемые для начала культуры) для остывания, а затем распределите каплю инокулюма по поверхности агара до тех пор, пока следы свободной жидкости не исчезнут. Установите на место крышку тарелки.
- Повторно разожгите разбрасыватель и повторите процесс со следующей пластиной, работая быстро, чтобы не загрязнить агар переносимыми по воздуху организмами
- Инкубируйте бактериальные пластины при комнатной температуре в течение 1 недели. Во время инкубации убедитесь, что пластины перевернуты, чтобы капли влаги от конденсата не попадали на поверхность агара.
3. Изготовление раскладных тарелок для актиномицетов
- Чтобы вырастить актиномицеты, возьмите три заранее приготовленные глицерин-казеиновые пластины и пометьте их как B, C и D. Используя методы, показанные ранее, распределите планшет на 0,1 мл из суспензий B, C и D. Более низкие разведения используются потому, что актиномицеты обычно присутствуют в 1/10 бактериальной популяции (B = 10-2, C = 10-3, D = 10-4).
- Инкубировать пластинки с актиномицетами (перевернутыми) при комнатной температуре в течение 2 недель.
4. Количество бактерий и актиномицетов
- После инкубации внимательно осмотрите все бактериальные пластины и обратите внимание на различия в размере и форме колонии. При выращивании на агаре бактерии образуют слизистые колонии от бесцветных до ярко-оранжевых, желтых или розовых. Напротив, колонии актиномицетов меловые, твердые, кожистые и ломаются под давлением, где другие колонии бактерий размазываются. Это позволяет отличить колонии на ощупь с помощью стерильной петли.
- Подсчитайте и запишите количество колоний бактерий, включая любые актиномицеты. Учитывайте только тарелки с 30-200 колониями на тарелке.
5. Изоляция чистых культур
- Выберите отдельные колонии бактерий с любой из пластин. Можно выбрать больше колоний, если есть особый интерес к почве. Используйте планшет с высоким содержанием разбавления, так как он, как правило, имеет чистые колонии, которые хорошо отделяются. Выбирайте только те колонии, которые хорошо отделены от соседних колоний и выглядят морфологически отличными друг от друга.
- Простерилизуйте петлю, окунув ее в спирт и обжег. Быстро откройте интересующую вас чашку Петри и прикоснитесь петлей к голому месту в агаре, чтобы охладить его. Затем удалите небольшое количество интересующей колонии на петлю.
- Взяв свежую пептонно-дрожжевую пластину, сделайте прожилку длиной в несколько сантиметров с одной стороны. Простерилизуйте и снова остудите, затем сделайте полосу, которая пересекает начальную полосу только на первом проходе. Повторите этот процесс еще дважды таким же образом. Это полосатое «разбавление» приводит к тому, что клетки в петле отделяются друг от друга. Поместите тарелку в темное место для инкубации при комнатной температуре в течение двух недель.
Источник: Лаборатории доктора Яна Пеппера и доктора Чарльза Герба - Университет Аризоны
Демонстрирующие авторы: Брэдли Шмитц и Луиза Икнер
Поверхностн…
1. Приготовление разбавлений почвы
- Чтобы начать процедуру, взвесьте 10 г образца почвы и добавьте к 95 мл деионизированной воды. Хорошенько встряхните подвеску, и наклейте на нее маркировку «А».
- До того, как почва осядет, удалите 1 мл суспензии стерильной пипеткой и переложите ее в деионизированную водную заготовку объемом 9 мл. Тщательно обработайте вихрь, и обозначьте как «В».
- Повторите этот этап разбавления три раза, каждый раз с 1 мл предыдущей суспензии и деионизированной водой объемом 9 мл. Обозначьте их последовательно как трубки C, D и E. Это приводит к серийному разведению от 10-1 до 10-5 граммов почвы на мл
2. Изготовление раскладных тарелок для бактериальной культуры
- Чтобы вырастить колонии бактерий, возьмите три заранее подготовленные пептонно-дрожжевые агаровые пластины и пометьте их как C, D и E. Образцы Vortex C, D и E и нанесите пипеткой 0,1 мл на каждую пластину. Это еще больше увеличивает величину разбавления в десять раз (C = 10-3, D = 10-4, E = 10-5).
- Далее опустите стеклянный разбрасыватель в этанол. Поместите разбрасыватель в пламя на несколько секунд, чтобы разжечь и сжечь этанол. Это позволит простерилизовать разбрасыватель.
- Держите разбрасыватель над первой пластиной, пока пламя не погаснет. Быстро откройте тарелку, прижав к себе крышку. Приложите разбрасыватель к агару в сторону от инокулюма (Инокулюм = клетки, используемые для начала культуры) для остывания, а затем распределите каплю инокулюма по поверхности агара до тех пор, пока следы свободной жидкости не исчезнут. Установите на место крышку тарелки.
- Повторно разожгите разбрасыватель и повторите процесс со следующей пластиной, работая быстро, чтобы не загрязнить агар переносимыми по воздуху организмами
- Инкубируйте бактериальные пластины при комнатной температуре в течение 1 недели. Во время инкубации убедитесь, что пластины перевернуты, чтобы капли влаги от конденсата не попадали на поверхность агара.
3. Изготовление раскладных тарелок для актиномицетов
- Чтобы вырастить актиномицеты, возьмите три заранее приготовленные глицерин-казеиновые пластины и пометьте их как B, C и D. Используя методы, показанные ранее, распределите планшет на 0,1 мл из суспензий B, C и D. Более низкие разведения используются потому, что актиномицеты обычно присутствуют в 1/10 бактериальной популяции (B = 10-2, C = 10-3, D = 10-4).
- Инкубировать пластинки с актиномицетами (перевернутыми) при комнатной температуре в течение 2 недель.
4. Количество бактерий и актиномицетов
- После инкубации внимательно осмотрите все бактериальные пластины и обратите внимание на различия в размере и форме колонии. При выращивании на агаре бактерии образуют слизистые колонии от бесцветных до ярко-оранжевых, желтых или розовых. Напротив, колонии актиномицетов меловые, твердые, кожистые и ломаются под давлением, где другие колонии бактерий размазываются. Это позволяет отличить колонии на ощупь с помощью стерильной петли.
- Подсчитайте и запишите количество колоний бактерий, включая любые актиномицеты. Учитывайте только тарелки с 30-200 колониями на тарелке.
5. Изоляция чистых культур
- Выберите отдельные колонии бактерий с любой из пластин. Можно выбрать больше колоний, если есть особый интерес к почве. Используйте планшет с высоким содержанием разбавления, так как он, как правило, имеет чистые колонии, которые хорошо отделяются. Выбирайте только те колонии, которые хорошо отделены от соседних колоний и выглядят морфологически отличными друг от друга.
- Простерилизуйте петлю, окунув ее в спирт и обжег. Быстро откройте интересующую вас чашку Петри и прикоснитесь петлей к голому месту в агаре, чтобы охладить его. Затем удалите небольшое количество интересующей колонии на петлю.
- Взяв свежую пептонно-дрожжевую пластину, сделайте прожилку длиной в несколько сантиметров с одной стороны. Простерилизуйте и снова остудите, затем сделайте полосу, которая пересекает начальную полосу только на первом проходе. Повторите этот процесс еще дважды таким же образом. Это полосатое «разбавление» приводит к тому, что клетки в петле отделяются друг от друга. Поместите тарелку в темное место для инкубации при комнатной температуре в течение двух недель.
Определение точного количества бактерий в окружающей среде имеет решающее значение для оценки здоровья почвенной экосистемы. Это может быть достигнуто путем культивирования бактериальных колоний с соответствующими разведениями.
Почвенные бактерии являются важной частью здоровой почвенной экосистемы, играя роль в разложении, фиксации азота и круговороте питательных веществ. Поверхностные почвы представляют собой субстрат из органических и неорганических частиц, образующих сложную матрицу, окружающую поры, которые заполняются воздухом или водой. Эти условия создают идеальную экосистему для бактерий, при этом поверхностные почвы обычно содержат более миллиона бактерий на грамм.
Из-за такой высокой концентрации бактерий необходимо разбавление перед нанесением на питательную среду. Серийные разведения могут снизить концентрацию исходного образца почвы до уровней, достаточно низких для выращивания отдельных колоний на средовых планшетах, что позволяет рассчитать первоначальное количество бактерий в образце почвы.
В этом видео показано, как готовить серийные разведения образцов почвы, как наносить эти бактериальные образцы и как вычислять количество почвенных бактерий на планшетах для разбавления.
Бактерии являются простыми прокариотическими организмами, но очень разнообразными с точки зрения видов и экосистем. Актиномицеты — это подмножество бактерий, которые часто считаются уникальной группой из-за их нитевидной структуры, где они растут, нанизывая друг на друга, образуя гифы.
Как правило, актиномицеты составляют 10% от общей популяции бактерий в почве. Бактерии и актиномицеты в изобилии встречаются почти во всех средах на Земле, но встречаются в беспрецедентном разнообразии и изобилии в почве.
Почвенные бактерии перечислены, потенциально культивируются и идентифицируются с помощью разбавляющего покрытия. Здесь образец почвы серийно разводят в воде, а затем распыляют на агаровые пластины роста. Затем подсчитываются полученные колонии. Это значение, наряду с коэффициентом разбавления, используется для выяснения начальной концентрации бактерий в почве.
Разбавляющее покрытие является распространенным, недорогим и простым методом подсчета бактерий, но он имеет несколько недостатков. Нельзя допускать оседания почвы во время разведений, что может привести к смещенному росту. Некоторые почвенные бактерии не культивируются на пластинах или растут слишком медленно, чтобы их можно было наблюдать. Кроме того, этот метод предполагает, что колонии образуются из одной бактерии, но они могут возникать из скоплений нескольких клеток.
Определенные виды бактерий лучше растут на различных питательных средах. Распространенным субстратом для культивирования широкого спектра бактерий является агар-пептонная дрожжевая пластина. Актиномицеты преимущественно растут на пластинах на основе глицерина-казеина, которые лучше подходят для роста этих нитчатых бактерий.
Теперь, когда вы понимаете концепцию подсчета бактерий, давайте посмотрим, как этот процесс осуществляется в лаборатории.
Для начала процедуры отвесьте 10 г образца почвы, и добавьте к 95 мл деионизированной воды. Хорошенько встряхните подвеску, и наклейте на нее маркировку «А». До того, как почва осядет, удалите 1 мл суспензии стерильной пипеткой и переведите ее в 9 мл деионизированной воды. Тщательно обработайте вихрь, и обозначьте как «В».
Повторите этот этап разбавления 3 раза, каждый раз с 1 мл предыдущей суспензии и 9 мл деионизированной воды. Обозначьте их последовательно как трубки C, D и E. Это приводит к серийному разведению от 10-1 до 10-5 граммов почвы на мл.
Чтобы вырастить колонии бактерий, возьмите 3 заранее приготовленные пептонно-дрожжевые агаровые пластины и пометьте их как C, D и E. Вортексите соответствующие образцы и нанесите пипеткой 0,1 мл на каждую пластину. Поскольку КОЕ рассчитываются на мл, использование 0,1 мл еще больше увеличивает разбавление в десять раз.
Далее опустите стеклянный разбрасыватель в этанол. Поместите разбрасыватель в пламя на несколько секунд, чтобы разжечь и сжечь этанол. Это позволит простерилизовать разбрасыватель.
Держите разбрасыватель над первой пластиной, пока пламя не погаснет. Быстро откройте тарелку, прижав к себе крышку. Приложите разбрасыватель к агару подальше от инокулюма для остывания, а затем распределите каплю инокулюма по поверхности до тех пор, пока следы свободной жидкости не исчезнут. Установите на место крышку тарелки.
Повторно разожгите разбрасыватель и повторите процесс со следующей пластиной, работая быстро, чтобы не загрязнить плиту переносимыми по воздуху организмами. Переверните пластины, чтобы капли влаги не попадали на агар, и выдержите пластины при комнатной температуре в течение одной недели.
Чтобы вырастить актиномицеты, возьмите три заранее приготовленные глицерин-казеиновые пластины и пометьте их как B, C и D. Используя методы, показанные ранее, распределите планшет на 0,1 мл из суспензий B, C и D. Используются более низкие разведения, потому что актиномицеты обычно присутствуют в 1/10 бактериальной популяции.
Наконец, переверните эти пластины и храните при комнатной температуре в течение двух недель.
После инкубации внимательно осмотрите все бактериальные пластины и обратите внимание на различия в размере и форме колонии. При выращивании на агаре бактерии образуют слизистые колонии от бесцветных до ярко-оранжевых, желтых или розовых. Напротив, колонии актиномицетов меловые, твердые, кожистые и ломаются под давлением, где другие колонии бактерий размазываются. Это позволяет отличить колонии на ощупь с помощью стерильной петли.
Подсчитайте и запишите количество колоний бактерий, включая любые актиномицеты. Учитывайте только тарелки с 30-200 колониями на тарелке.
Чтобы вырастить культуры конкретных отдельных бактерий, подбирайте дискретные колонии с любой из пластин, выбирая колонии, которые хорошо отделены от соседних колоний. Простерилизуйте петлю для размазывания, затем откройте тарелку и прикоснитесь петлей к пустому месту, чтобы остыть. Затем выберите небольшое количество интересующей вас колонии на петле.
Взяв свежую пептонно-дрожжевую пластину, сделайте прожилку длиной в несколько сантиметров с одной стороны. Простерилизуйте и снова остудите, затем сделайте полосу, которая пересекает начальную полосу только на первом проходе. Повторите этот процесс еще дважды таким же образом. Это полосатое «разбавление» приводит к тому, что клетки в петле отделяются друг от друга. Поместите тарелку в темное место для инкубации при комнатной температуре в течение двух недель.
По количеству колоний бактерий и актиномицетов можно определить колониеобразующие единицы на грамм почвы. Число колоний на грамм почвы равно числу колоний, подсчитанных на пластине, умноженному на величину, обратную разбавленному пластине. Например, если на разбавляющей пластине 46 10-5 с инокулянтом 0,1 мл насчитать колонии, то КОЕ на грамм почвы равняется 10-6 на 46, или 46 млн КОЕ на грамм почвы.
Проведение подсчета и бактериологического исследования является ключевым первым шагом во многих научных исследованиях или протоколах.
Здоровая почва содержит от 106 до 108 бактерий на грамм. Бактериальный подсчет почв может быть использован для определения здоровья почв, представляющих интерес, а количество менее 106 и 108 бактерий на грамм указывает на нездоровую или бедную почву. Это может быть вызвано недостатком питательных веществ или органических веществ, абиотическим стрессом из-за чрезмерного pH почвы или загрязнением почвы.
Многие виды антибиотиков, используемых сегодня в медицине, были впервые идентифицированы из обитающих в почве бактерий или грибов. Выделение чистых штаммов из почвенных культур может помочь ученым в выявлении новых антибиотических соединений. Здесь тестовые бактерии или изолированные соединения, представляющие интерес, могут быть добавлены в пластины, выращенные с бактериальными газонами, и зафиксировано их влияние на рост газона. Прозрачные участки на бактериальных газонах, рост которых был подавлен исследуемыми бактериями или соединением, могут указывать на активность антибиотиков.
Бобовые растения, включая горох и фасоль, полагаются на симбиотические отношения с азотфиксирующими бактериями. Эти бактерии свободно живут в почве или в клубеньках корневой системы и производят соединения азота, которые утилизируются растением. На бедных почвах добавление в бобовые культуры культивируемых азотфиксирующих бактерий из почвы может улучшить рост и здоровье растений. Это может привести к более крупным и выносливым растениям, которые, в свою очередь, дают больший урожай.
Вы только что посмотрели введение JoVE в перечисление бактерий. Теперь вы должны понять, как проводить разбавление образцов почвы, как проводить подсчет колоний и их изоляцию, а также как подсчитывать количество бактерий в образцах почвы. Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is dilution necessary when culturing bacteria from soil samples?
Soil typically contains over one million bacteria per gram, making direct plating impossible for accurate colony counting. Serial dilutions reduce bacterial concentration to levels where individual colonies can grow separately on media plates, enabling accurate enumeration and calculation of the original bacterial population in the soil sample.
Q2: What is the difference between bacteria and actinomycetes in soil?
Actinomycetes are filamentous bacteria that grow strung together to form hyphae, distinguishing them from typical bacteria. They account for approximately 10% of the total bacterial population in soil and preferentially grow on glycerol-casein based plates, whereas most bacteria grow on peptone-yeast agar plates.
Q3: How do you prepare serial dilutions of a soil sample for bacterial enumeration?
Weigh 10 grams of soil and add to 95 milliliters of deionized water, then shake well. Transfer 1 milliliter to 9 milliliters of fresh water and vortex. Repeat this process four times sequentially, creating dilutions from 10-1 through 10-5 grams of soil per milliliter, ensuring the soil does not settle between transfers.
Q4: What colony characteristics distinguish actinomycetes from other bacteria on agar plates?
Actinomycete colonies appear chalky, firm, and leathery, breaking under pressure when touched with a sterile loop. In contrast, typical bacterial colonies are slimy and range from colorless to bright orange, yellow, or pink, smearing when touched. These tactile differences allow easy distinction between colony types.
Q5: How is the colony forming unit count calculated from dilution plates?
Multiply the number of colonies counted on the plate by the reciprocal of the dilution factor. For example, 46 colonies on a 10-5 dilution plate with 0.1 milliliter inoculant equals 46 million CFUs per gram of soil. Only count plates containing 30-200 colonies for accuracy.
Q6: What do bacterial counts reveal about soil health?
Healthy soil contains between 10-6 and 10-8 bacteria per gram. Counts below 10-6 or above 10-8 indicate unhealthy soil, potentially caused by nutrient deficiency, organic matter loss, extreme pH, or contamination. Bacterial enumeration serves as a key indicator for assessing soil ecosystem health and quality.
Q7: How can isolated soil bacteria be used to identify antibiotic compounds?
Test bacteria or compounds are added to plates containing bacterial lawns, and growth inhibition is observed. Clear patches where growth was inhibited may indicate antibiotic activity. This method allows scientists to screen isolated soil bacteria for potential new antibiotic compounds with medical applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:25
Principles of Culturing and Enumerating Soil Bacteria
3:33
Preparation of Soil Dilutions
4:29
Making Spread Plates for Bacterial Culture
6:20
Bacterial and Actinomycetes Counts
7:09
Isolation of Pure Cultures
8:41
Applications
10:31
Summary