Анализ кривой роста бактерий и его применение в окружающей среде

Измерение скорости роста бактерий является фундаментальным микробиологическим методом и широко используется в фундаментальных исследованиях, а также в сельском хозяйстве и промышленности.

Бактерии являются одними из самых распространенных форм жизни на Земле, они присутствуют в каждой экосистеме, включая человеческое тело. Некоторые виды бактерий также генетически хорошо поддаются лечению и были использованы в качестве исследовательских моделей или для производства натуральных или синтетических продуктов в промышленных масштабах. Однако не все виды бактерий можно культивировать в лаборатории. Для тех, кто может, важной характеристикой является скорость размножения, или «кинетика роста».

Измерение скорости роста бактериальной культуры может информировать ученых об их физиологических и метаболических функциях, а также полезно для получения точного количества клеток бактерий для последующего применения.

В этом видео мы познакомимся с принципами анализа темпов роста бактерий, продемонстрируем протокол для определения скорости роста с помощью «кривой роста» и, наконец, рассмотрим несколько применений науки об окружающей среде для измерения кинетики роста бактерий.

Бактерии обычно размножаются бесполым путем, размножаясь путем простого бинарного деления, когда одна родительская клетка делится на две идентичные дочерние клетки. При благоприятных условиях роста, где питательные вещества доступны в изобилии и такие параметры окружающей среды, как температура, благоприятствуют росту, скорость размножения намного превышает скорость смертности. Это приводит к экспоненциальному росту.

Измеряя количество бактерий в культуре в зависимости от времени, можно получить кривую роста. Выращивание бактерий в жидкой культуре в оптимальных условиях дает кривую роста с характерной формой, которую можно разделить на различные фазы. Кривая начинается с «фазы запаздывания», когда рост идет медленно, в то время как бактерии акклиматизируются к условиям культивирования. Далее следует «логарифмическая» или «экспоненциальная фаза», когда бактерии испытывают экспоненциальный рост. Рост в конечном итоге останавливается, когда питательные вещества истощаются, а продукты жизнедеятельности накапливаются, что приводит к «стационарной фазе». Наконец, как только скорость размножения обгоняется скоростью клеточной смерти, культура вступает в «фазу смерти».

Для построения кривой роста подсчитывают количество бактерий в колбе с жидкой культурой в разные моменты времени в течение определенного периода культивирования. Подсчет бактерий может быть получен с помощью ряда различных методов. Одним из распространенных подходов является измерение оптической плотности - или "OD" - 600, которая представляет собой поглощение бактериальным раствором света на длине волны 600 нм.

Другой метод заключается в определении «КОЕ», или колониеобразующих единиц, на миллилитр культуры. Из-за клональной природы бактериального роста одна бактерия в культуре теоретически может разрастаться в одну наблюдаемую колонию на агаровой пластине. С помощью серии разведений бактериальной культуры для достижения бактериальной концентрации, при которой можно наблюдать отдельные, дискретные колонии, метод, называемый «серийным разведением», количество колоний может быть использовано для обратного расчета концентрации бактерий в терминах КОЕ на мл.

Теперь, когда вы понимаете, как можно анализировать рост бактерий, давайте рассмотрим протокол проведения анализа кривой роста на чистых культурах хорошо зарекомендовавшей себя бактериальной модели, Escherichia coli, с использованием метода серийного разбавления.

За день до сбора введите 20 мл предварительно стерилизованного соевого бульона триптиказы (TSB) в колбу объемом 50 мл с одной колонией кишечной палочки.

Инкубируйте культуру за ночь при 37 ? C с встряхиванием. Для E. coli это привело бы к популяции в стационарной фазе примерно 109 КОЕ/мл.

На следующий день сделайте прививку 100 ? L ночного посева на 250 мл TSB в колбе объемом 500 мл. Тщательно перемешиваем. В результате получается разбавленная культура примерно 4 x 105 КОЕ/мл. Храните 5 мл этой разведенной культуры в пробирке для культивирования. Это аликвота от временной точки 0, или T0. Немедленно охладите при 4 °C.

Инкубируйте оставшийся объем культуры при 37 °C. C с встряхиванием. После этого каждый час в течение 8 ч собирайте 5 мл аликвот из культуры. Обозначьте эти образцы от Т1 до Т8 и сохраните их все в точке 4 ? C до использования.

В день эксперимента достаньте аликвоты E. coli из холодильника и держите их на льду. Используйте стерильные пробирки с микрофугами, каждая по 900 ? L стерильного физиологического раствора, чтобы установить серию разведения для каждой аликвоты в соответствии со следующей таблицей.

Хорошо перемешайте культуру T0, слегка перемешав, затем добавьте 100 ? L в пробирку А его серии разведения, делая разведение 1-в-10 или 10-1. Перемешайте вихревую трубку А и с помощью свежего наконечника для пипетки добавьте 100 ? L из трубки А в трубку В, делая разведение 1-в-100, или 10-2.

Повторите процесс для каждой аликвоты культуры и сделайте соответствующую серию разведения в соответствии с таблицей 2. После того, как серия разведения для всех образцов временной точки будет изготовлена, подготовьте соответствующее количество стерильных триптиказных соевых агаровых пластин для бактериального покрытия.

3 разведения каждой культуры временной точки будут нанесены в тройном порядке в соответствии со следующей таблицей. Наклейте соответствующие маркировки на пластины. Тогда пипетка 100 ? L каждой надлежащим образом разведенной культуры на центр соответствующей агаровой пластины. Простерилизуйте пламенем стеклянный стержень в форме буквы «L», охладите, прикоснувшись стержнем к агару вдали от инокулюма, и немедленно распределите жидкость по поверхности агара. Обратите внимание, что задержка в распространении может привести к чрезмерному росту бактерий в месте прививки.

Продолжайте нанесение покрытия на каждую серию разбавления для всех 9 культур временных точек, стерилизуя пламенем стеклянный разбрасывающий стержень между каждой серией разведения.

После того, как пластины высохнут в течение нескольких минут, переверните и поместите их в 37 ? C инкубатором на ночь. После этого периода роста пластины можно хранить при температуре 4 °C.

После ночной инкубации разбавляющих пластин осмотрите их на предмет загрязнения и однородности колоний. Для каждой временной точки культуры выберите разведение, для которого на пластине имеется от 30 до 300 колоний. Подсчитайте количество колоний на каждой из трех пластин для этого разведения.

Используя среднее число колоний для каждого разведения и коэффициент разведения, рассчитайте концентрацию бактерий в исходной культуре в каждый момент времени в КОЕ/мл. Например, если из тройного набора планшетов получено в среднем 30 колоний, полученных из 0,1 мл 10-4, или 1 на 10 000, то будет 30 колоний, разделенных на 0,1 мл, умноженных на 10 000, или 3 млн КОЕ/мл.

Используя концентрацию бактерий, рассчитанную для каждой точки времени, постройте график логарифма концентраций бактерий по основанию 10 в КОЕ/мл в зависимости от времени в часах. На графике определите логарифмическую фазу роста исходной бактериальной культуры и выберите две временные точки в пределах логарифмической фазы, обозначив первую из этих временных точек как t = 0. Вычислите среднее время генерации с помощью уравнения X равно 2 в степени n, умноженной на X0, где X — концентрация бактерий в момент времени t, X0 — начальная концентрация при t = 0, а n — количество поколений, прошедших между двумя временными точками.

Например, предположим, что X0 составляет 1000 КОЕ/мл, а при t = 6 ч концентрация равна 16000 КОЕ/мл. Используя уравнение, мы получаем, что 4 поколения произошли в течение 6 часов, что дает время генерации 6, разделенное на 4 или 1,5 часа на поколение.

Измерение кинетики роста бактерий имеет основополагающее значение для многих приложений в исследованиях, сельском хозяйстве или биоинженерии.

Одним из способов получения информации о скорости роста бактерий является получение точного количества бактериальной культуры для инокуляции другой культуры или среды. Например, некоторые культуры, такие как бобовые, должны быть выращены с симбиотическими бактериями, известными как ризобии, которые колонизируют корни растений, образуя клубеньки и «фиксируя» азот, превращая атмосферный азот в аммиак, который может быть использован растением. Для применения в сельском хозяйстве известное количество ризобий добавляют в углеродную среду на основе торфа, которая затем используется для инокуляции семян бобовых для создания симбиоза растений и бактерий.

Анализ роста также может быть использован для выявления видов бактерий, которые могут разлагать промышленные отходы и, возможно, производить ценные побочные продукты. В этом примере исследователи исследовали, как питательная среда с добавлением черного щелока, отхода производства древесной целлюлозы и бумаги, влияет на рост микробного изолята окружающей среды.

Бактерии не только продемонстрировали усиленный рост с черным щелоком, но и показали «дифазическую» модель роста, указывающую на наличие более одного источника углерода в черном щелоке, который бактерии могут метаболизировать. Затем можно было извлечь отдельные компоненты черного щелока для более детального анализа роста.

Наконец, измерения скорости роста также полезны для определения характеристик бактерий, которые были разработаны для конкретных промышленных целей, например, для устранения нефтяных загрязнений. Здесь ученые создали генетически модифицированные штаммы бактерий, которые содержат ферменты для разложения углеводородных компонентов нефти. Анализ роста был проведен, например, для того, чтобы убедиться, что модифицированные бактерии имеют повышенную скорость роста по сравнению с обычными бактериями в присутствии токсичных углеводородов, что указывает на улучшенную переносимость, которая позволит сконструированным бактериям выполнять свою функцию по очистке от загрязнения.

Вы только что посмотрели видео JoVE об анализе темпов роста бактерий с помощью кривых роста. Теперь вы должны понять различные фазы роста бактериальных культур, как провести эксперимент для получения кривой роста с использованием сбора временных точек и серийного разбавления, а также как анализ роста может быть применен в исследовательских и промышленных целях. Как всегда, спасибо за просмотр!