Анализ кривой роста бактерий и его применение в окружающей среде

1. Сбор аликвот бактериальной культуры

1. За день до сбора временных точек роста закиньте 20 мл среды триптиказного соевого бульона (TSB) в колбу объемом 50 мл E. coli.
2. Инкубировать в течение ночи при температуре 27 °C. Этот относительно длительный инкубационный период приводит к тому, что популяция дикого типа E. coli составляет примерно 10⁹ КОЕ/мл.
3. На следующий день используйте 100 мкл приготовленной культуры для посева 250 мл TSB (в колбу объемом 500 мл). Тщательно перемешиваем. Выньте аликвоту объемом 5 мл и сразу же поставьте в холодильник при температуре 4 °C. Это временная точка T = 0 или T₀, и должна содержать примерно 4 x 10⁵ КОЕ/мл.
4. Поместите колбу с оставшимся E. coli (245 мл) в инкубатор с встряхиванием при температуре 37 °C. Удаляйте 5 мл аликвот культуры каждый час, до 8 ч. Храните каждую аликвоту при температуре 4 °C. Обозначьте эти аликвоты от T₁ до T₈.

2. Серийное разведение

1. Достаньте аликвоты E. coli из холодильника и положите на лед для транспортировки. Храните все культуры на льду до использования.
2. Настройте ряд пробирок для разведения для получения различных разведений каждой культуры E. coli (Рисунок 3). Для этой функции удобны микрофуговые пробирки. В каждой разводящей пробирке должно быть 900 μл разбавляющей жидкости (стерильного физиологического раствора). Ряд разведения необходим для каждой культуры E. coli (от T₀ до T₈); Промаркируйте каждую трубку в соответствии с Таблица 2.
   
   Рисунок 3. Схема, показывающая процедуру нанесения E. coli.
3. Начните разведение с добавления 100 μL E. coli из пробирки, помеченной как T₀ (исходная культура E. coli) в пробирку А, которая представляет собой 10^-1 разведение T₀. Закрутите трубку в течение 5 с.
4. Затем добавьте 100 мкл пробирки А в следующую пробирку с физиологическим раствором, пробирку В, которая представляет собой 10^-2 разведение T₀. Продолжайте необходимый ряд разбавления для каждой временной точки аликвоты. Не забудьте сделать вихревую обработку каждой трубки перед переносом. Также важно использовать новый наконечник для дозатора для каждой передачи.

E. coli культура	Необходимы разведения и пробирка #
	А	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Таблица 2. Серия разведения требуется для каждой культуры E. coli.

3. Покрытие

1. Три разведения для каждого E. coli Культура временной точки будут нанесены в соответствии с Таблица 3. Маркировка табличек с указанием временной точки (T₁ до T₈), коэффициента разбавления и добавляемого объема. Для каждого разведения используйте тройные пластины.
2. Добавьте по 100 мкл каждого разведения в планшет, дозируя это количество до центра агаровой пластины (Рисунок 3). Немедленно распределите аликвоту с помощью стерилизованного пламенем стеклянного стержня в форме буквы «L». Если аликвоту не распределить немедленно, она сорбирует in situ на пластине, что приводит к чрезмерному росту бактерий в месте первоначального инокуляции.
3. Повторите нанесение покрытия для каждого ряда разрежений для временных точек T₁ - T₈. Не забывайте стерилизовать стержень между пластинами и особенно между разными разведениями.
4. Как только пластины высохнут в течение нескольких минут, переверните и поместите в инкубатор с температурой 37 °C на ночь. Переворачивание пластин предотвращает попадание конденсата на агаровую пластину. После ночной инкубации тарелки следует хранить в холодильнике.

E.coli культура	Разведения, подлежащие нанесению
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^*Более низкие разведения учитывают более низкие популяции из-за фазы смерти.

Таблица 3. Протокол гальванического покрытия для культур E. coli.

4. Подсчет колоний и вычисление среднего времени генерации

1. Осмотрите пластины на однородность колоний и отсутствие загрязнения.
2. Для каждой временной точки (от T₀ до T₈) выберите одно разведение, содержащее от 30 до 300 колоний, и посчитайте тройные пластины.
3. Используя коэффициент разведения, рассчитайте количество клеток на мл исходной культуры в моменты времени от T₀ до T₈. Например, если количество колоний, полученных в результате разведения 10^-4, равно 30, 28 и 32:
   Среднее число колоний = 30 колоний
   Они возникали в результате 0,1 мл 10^-4 разведения
   Количество колоний на мл = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Plot log₁₀ КОЕ/мл в зависимости от времени (в часах).
5. Исходя из графика, определите экспоненциальную фазу роста. Используя 2 временные точки в фазе экспоненциального роста и соответствующие номера ячеек в каждый момент времени, вычислите среднее время генерации.