Подсчет водорослей с помощью культивируемой методологии

Водоросли — это фотосинтезирующие организмы, которые живут в различных средах. Почвенные водоросли можно культивировать в лаборатории, а их концентрацию перечислить с помощью простых расчетов.

Водоросли представляют собой весьма неоднородную группу организмов, которые имеют одну общую черту, а именно обладание фотосинтетическими пигментами, обычно хлорофиллом. Подавляющее большинство водорослей являются микроскопическими, однако точное определение группы является спорным, а также включает в себя морские водоросли, которые обычно имеют макроскопические размеры.

В окружающей среде водоросли могут вызывать проблемы в поверхностных водах, таких как озера или водохранилища, образуя цветение водорослей, которые истощают питательные вещества воды, блокируют прохождение света за пределы поверхности воды и выделяют токсины. Возможность перечислять водоросли в образцах позволяет ученым оценить состояние экосистемы и потенциальный риск чрезмерного роста водорослей.

Популяции водорослей в почвах часто составляют около десяти тысяч клеток на грамм. Эти цифры, как правило, ниже, чем соответствующие концентрации бактерий, грибов или актиномицетов, поскольку водорослям требуется солнечный свет для фотосинтеза, который не может проникнуть глубоко под поверхность почвы.

В этом видео будет показано, как выращивать водоросли из почвы в лабораторных условиях, и как перечислить концентрацию водорослей в исходном образце почвы.

Водоросли благотворно влияют на экосистемы. Сине-зеленые водоросли, или цианобактерии, обладают способностью фиксировать газообразный азот из атмосферы, что делает их полезными для увеличения азота в почве в полузасушливых условиях, а также в качестве потенциального инструмента для производства биотоплива.

Другие водоросли являются эукариотами и варьируются от одноклеточных до сложных многоклеточных организмов, таких как морские водоросли. К ним относятся зеленые водоросли, эвгленоиды, динофлагелляты и диатомовые водоросли, бурые водоросли и красные водоросли.

Водоросли являются фототрофными, получая энергию от фотосинтеза и углерод для биомассы из углекислого газа. В результате их можно выращивать в средах, полностью состоящих из неорганических питательных веществ, без добавления органического углеродного субстрата. Этот недостаток органического субстрата препятствует росту гетеротрофных бактерий, рост которых зависит от внешнего органического углерода.

Для культивирования водорослей для подсчета образцы почвы серийно разбавляют в десять раз до 10-6 г почвы на мл, и культивируют в питательных средах. Для каждого разведения изготавливается несколько повторов. Затем их инкубируют в хорошо освещенном месте в течение 4 недель, чтобы дать возможность росту водорослей.

Присутствие водорослей в любом разведении определяется положительным признаком роста в среде, которая обычно выглядит в виде зеленого слайма. Наконец, мы обращаемся к эмпирически разработанным таблицам МПН, предназначенным для роста водорослей, что позволяет пользователю определить исходную концентрацию водорослей на основе роста реплик разведения. Метод МПН основан на серийном разбавлении образцов таким образом, что водоросли разбавляются до полного исчезновения, что означает, что при некотором разведении рост водорослей не происходит.

Теперь, когда мы знакомы с концепциями, лежащими в основе выращивания и подсчета водорослей из образцов, давайте рассмотрим, как это осуществляется в лаборатории.

Чтобы начать эксперимент, сначала взвесьте 10 граммов влажной почвы, которая либо была собрана влажным с поля, либо была повторно увлажнена и оставалась влажной в течение 2-3 дней. Почва должна быть насыщенной, но не насыщенной.

Затем приготовьте серию десятикратного разбавления, добавив сначала 10 граммов почвы к 95 мл модифицированного раствора Бристоля, или MBS. Обозначьте это как суспензия А.

После энергичного встряхивания продолжайте серию разведения, добавляя 1 мл суспензии А к 9 мл MBS в пробирку. Продолжайте этот десятикратный ряд разведения еще 4 раза, чтобы получить разведения до 10-6 г на мл.

Затем инокулируют 5 реплицирующих пробирок, каждая из которых содержит 9 мл MBS с 1 мл каждого из разведений от 10-1 до 10-5. В результате получается 5 повторяющихся пробирок на каждое разведение от 10-2 до 10-6. Неплотно закройте трубки.

Наконец, инкубируйте пробирки в течение полных 4 недель в месте, подверженном воздействию солнечных лучей. Наблюдайте за трубками на предмет роста водорослей один раз в 7 дней. Трубки, демонстрирующие рост водорослей, будут казаться зелеными.

Анализ наиболее вероятных чисел, или МПН, является широко используемым математическим методом для подсчета микроорганизмов, выращенных в результате разбавления концентрированного исходного субстрата. Принимая во внимание коэффициенты разбавления растворов и количество пробирок, которые демонстрируют положительные признаки роста при каждом разбавлении, можно рассчитать наиболее вероятное количество организмов на грамм исходного образца почвы с помощью таблицы МПН и простой формулы.

Для расчета МПН наибольшему разведению с наибольшим числом положительных реплицитных пробирок присваивается метка p1, в данном случае репликации пробирки C. Напротив, некоторые из трубок от D & E отрицательные и без признаков роста водорослей.

Количество пробирок в следующих двух более высоких разведениях, которые показывают положительный рост, помечено как p2 и p3. Здесь p2 = D и p3 = E.

Значение p1 можно найти, посмотрев вниз на первый столбец в таблице MPN. То же самое следует сделать и со столбцом p2. Наконец, значение p3, расположенное сверху, используется для пересечения двух значений, определенных p1 и p2, чтобы получить значение наиболее вероятного числа организмов на мл.

Далее для расчета концентрации организмов на грамм в исходном образце почвы эту величину делят на концентрацию почвы в разбавлении, к которому был отнесен p2. Следующее уравнение используется для определения фактического количества организмов на грамм почвы.

Перечисление водорослей и анализ MPN имеют широкий спектр применений, некоторые из которых рассматриваются здесь.

Этот метод подсчета водорослей может быть использован в различных условиях. Его можно применять к рекам или озерам для определения уровня водорослей и оценки рисков вредоносного цветения водорослей. В качестве альтернативы его можно использовать для оценки чистоты и безопасности вод, непосредственно используемых человеком, включая бассейны, фонтаны или другие источники питьевой воды. В идеале, в пробах питьевой воды и бассейнах водорослей нет.

Анализ МПН для подсчета может быть также применен к другим микроорганизмам, не относящимся к водорослям. Например, качество воды можно оценить с помощью индикаторных организмов, таких как кишечные палочки или кишечная палочка. Здесь образцы могут быть культивированы в средах, содержащих химические вещества, которые изменяются для получения цвета или флуоресценции в присутствии индикаторных организмов. Проведя несколько небольших повторений этого эксперимента на отдельных клетках с образцами, разбавленными до известной концентрации, можно соотнести соотношение положительных клеток с таблицей МПН для конкретного индикаторного организма и определить начальную концентрацию в образцах.

Водоросли также могут культивироваться для коммерческого использования. Например, в некоторых видах биоудобрений используются сине-зеленые водоросли, которые могут действовать как симбионты с растениями, способствуя их закреплению и поглощению азота, что особенно полезно для роста сельскохозяйственных культур в районах с бедной почвой. Точно так же водоросли можно выращивать для производства биотоплива или в качестве источника богатой питательными веществами пищи для скота.

Вы только что посмотрели введение JoVE в культуру водорослей и их перечисление. Теперь вы должны понять, как разбавлять образцы почвы для роста водорослей, как выращивать водоросли в лаборатории и как подсчитывать концентрацию водорослей в исходных образцах. Спасибо за просмотр!