5.5: Идентификация грызунов II

1. Татуировка на хвосте

Татуировки на хвосте легко читаются без необходимости брать животное в руки.

Рисунок 1. Татуировка на хвосте у взрослых мышей

1. Подготовьте тату-оборудование в соответствии с инструкциями производителя. Потребуется небольшое количество чернил. Черный краситель следует использовать для мышей-альбиносов или крыс, а зеленый краситель – для пигментированных мышей или крыс.
2. Подготовьте животных к идентификации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму опасения или стресс, татуировка хвоста должна выполняться в процедурном кабинете, а не в зоне содержания животных.
   1. Соответствующим образом удерживайте животное для нанесения татуировки, чтобы движения были минимальными.
   2. Отлученных от груди крыс удерживают с помощью пластиковой чашки с насечкой, при этом край чашки закреплен под болтами на платформе для татуировки, а хвост проходит через выемку.
   3. Взрослых мышей можно удерживать с помощью ограничителя чашки, при этом хвост туго вытягивается из отверстия, а фланец чашки удерживается на месте с помощью платформы или другого устройства.
   4. Очистите хвост небольшим количеством разбавленного очистителя тканей, нанесенного тампоном с ватным наконечником. Взрослые крысы обычно имеют накопки и мусор на хвосте, которые необходимо очистить перед нанесением татуировки. Мыльно-водный скраб для хвоста удалит большую часть грязи и мусора. Хорошо просушите хвост, прежде чем продолжить.
   5. Нанесите тканевое масло на кожу с помощью ватного тампона непосредственно перед нанесением татуировки. Тканевое масло необходимо для минимизации повреждения тканей за счет размягчения кожи и смазки иглой для татуировки. Кроме того, масло растворяет любую грязь, не удаленную в процессе очистки, и предотвращает появление чернил на нетатуированной коже.
3. Нанесите татуировку.
   1. Окуните кончик иглы в пигмент при выключенной машинке.
   2. Поднесите кончик иглы к месту татуировки с помощью пистолета, активируемого ножной педалью.
   3. Делайте короткие, ровные мазки в одном направлении. Цифры и буквы должны быть вытатуированы таким образом, чтобы они были построены сегментами с минимальными углами и кривыми (когда это возможно).
   4. Проникните иглой достаточно глубоко в дерму для постоянного отложения пигмента. Изменение звука активированной иглы может помочь различить глубину.
   5. Подойдите к коже иглой под углом 90^o для адекватного осаждения пигмента.
4. Чистка и уход после татуировки
   1. Промокните (не вытирайте) готовую татуировку от излишков пигмента бумажным полотенцем.
   2. Наличие крови на татуировке или бумажном полотенце указывает на то, что татуировка была сделана слишком глубоко, и поэтому вряд ли будет постоянной.
   3. Укрепите тонкие участки татуировки символов дополнительным пигментом. Символы усилены пигментом, нанесенным параллельно, но не поверх уже нанесенного пигмента.
   4. Чтобы добавить дополнительный пигмент, опустите кончик иглы в резервуар с красителем через каждые два символа для мышей и каждый символ для крыс.
   5. Причинами выцветания татуировок являются недостаточное количество пигмента, татуировки, сделанные слишком поверхностно, татуировки, сделанные слишком глубоко, неподходящий угол наклона иглы к коже, использование тупых или крючковатых игл или татуировка, сделанная слишком быстро.
   6. Тщательно очищайте тату-оборудование после каждого использования в соответствии с инструкциями производителя.

2. Татуировка пальцев ног новорожденных

Экспериментальные протоколы могут потребовать генотипирования новорожденных уже в первый день, что делает необходимым постоянную идентификацию этих щенков. Использование татуировки на пальцах ног позволяет идентифицировать животных до тех пор, пока они не станут достаточно большими, чтобы их можно было пометить ушами или проколоть уши.

Рисунок 2. Правильная техника фиксации для нанесения татуировки новорожденной мыши. Ланцет имеет зеленый краситель на кончике.

1. Сдерживайте отлученных от груди щенков.
   1. Положите новорожденного в руку на марлевую салфетку. Расположите ступню между большим пальцем и сгибом указательного пальца, чтобы обнажить выбранный палец ноги или пальцы ног для нанесения татуировки.
   2. Держите стопу близко к пальцам ног так, чтобы носок имел за собой твердую поверхность, предотвращающую его изгиб.
   3. Не перекручивайте ногу при постановке стопы. Пристегнутые щенки могут покачиваться, но не обязательно слышать вокализацию.
2. Подготовьте оборудование.
   1. Выберите ланцет для животных Goldenrod диаметром 4,5 мм.
   2. Нанесите небольшое пятнышко зеленой пасты для татуировки на непористую поверхность; Хорошо подходит алюминиевая фольга.
   3. Окуните в пасту для татуировки только кончик ланцета.
   4. Используйте только небольшое количество пасты.
3. Нанесите татуировку.
   1. Проткните нужный палец лапы ланцетом Goldenrod в соответствии с идентификационным кодом.
   2. Проколите кожу, чтобы ввести пасту в кожу, оставив след.
   3. Проткните одно и то же место три раза, чтобы обеспечить правильное проникновение.
   4. Избегайте настолько глубоких протыканий, чтобы палец ноги не кровоточил; Это может привести к более тусклой татуировке.
4. Чистка и уход после татуировки
   1. Аккуратно промокните пятно впитывающей салфеткой/полотенцем, чтобы удалить излишки пасты.
   2. Не пытайтесь смыть излишки пасты со стопы или тела.
   3. Верните животное в клетку.
   4. Когда кормящим щенкам делают татуировку, желательно также сделать татуировку на матери. Это может предотвратить чрезмерную реакцию на пасту на щенках, что может привести к чрезмерному уходу за татуировкой.
   5. Используйте новый ланцет для каждого помета.
   6. Татуировки должны быть верифицированы на следующий день после процедуры. Повторите татуировку, если точки тусклые или не видны. Если точки видны на следующий день после нанесения татуировки, они должны оставаться видимыми в течение всей жизни животного.

3. Татуировка на пальцах ног взрослых крыс и мышей

Когда на выводке новорожденных делается татуировка, рекомендуется сделать татуировку и матери, чтобы паста на ее детенышах не была для нее чуждой.

1. Усмирение животного.
   1. Удерживайте животное с помощью пластикового конуса или ограничителя из плексигласа, который обеспечивает доступ к задним лапам.
   2. Вытяните ногу из удерживающего устройства.
   3. Расположите ногу между большим пальцем и сгибом указательного пальца, чтобы обнажить выбранный палец или пальцы ног для нанесения татуировки
   4. Держите стопу близко к пальцам ног так, чтобы за пальцем ноги была твердая поверхность, предотвращающая сгибание пальца ноги.
   5. Не перекручивайте ногу при постановке стопы. Взрослые, которых сдерживают, могут попытаться отвести ногу.
2. Подготовьте оборудование.
   1. Выберите ланцет для животных Goldenrod 5 мм.
   2. Нанесите небольшое пятнышко зеленой пасты для татуировки на непористую поверхность; Хорошо подходит алюминиевая фольга.
   3. Окуните в пасту для татуировки только кончик ланцета.
   4. Используйте только небольшое количество пасты.
3. Нанесите татуировку.
   1. Проткните нужный палец лапы ланцетом Goldenrod в соответствии с идентификационным кодом.
   2. Проколите кожу, чтобы ввести пасту в кожу, оставив след.
   3. Проткните одно и то же место три раза, чтобы обеспечить правильное проникновение.
   4. Избегайте настолько глубоких протыканий, чтобы палец ноги не кровоточил; Это может привести к более тусклой татуировке.
4. Чистка и уход после татуировки
   1. Аккуратно промокните пятно впитывающей салфеткой/полотенцем, чтобы удалить излишки пасты.
   2. Не пытайтесь смыть излишки пасты со стопы или тела.
   3. Верните животное в клетку.
   4. Используйте новый ланцет для каждого животного.
   5. Татуировки должны быть верифицированы на следующий день после процедуры. Повторите татуировку, если точки тусклые или не видны. Если точки видны на следующий день после нанесения татуировки, они должны оставаться видимыми в течение всей жизни животного.

4. Микрочипирование

Вживление RFID-чипа является широко используемым методом идентификации животных.

1. Загрузите микрочип в аппликатор или выберите предварительно загруженный шприц.
2. Удерживайте животное с помощью удерживающей трубки из плексигласа, которая позволяет захватывать кожу через плечи.
3. Наденьте тент на кожу, создав карман.
4. Поместите иглу через кожу, скос вверх и параллельно позвоночнику, и направьте его в сторону хвоста.
5. Извлеките микрочип подкожно.
6. Извлеките иглу и сожмите кожу в месте инъекции. Это предотвращает вывод микрочипа за иглой из кожи. Продолжайте оказывать давление, чтобы обеспечить гемостаз при любом кожном кровотечении.
7. Извлеките животное из удерживающего устройства и отсканируйте чип для подтверждения идентификационного кода.

Рисунок 3. Размещение микрочипов у взрослых крыс.

5. Временная идентификация мышей

Для временной идентификации мышей можно использовать нетоксичные красители и маркеры животных.

1. Задержите мышь так, чтобы область между лопатками была доступна для отметин на шерсти.
2. Нанесите маркер, пятно или полоску краски на шерсть в этой области. Эта область используется для того, чтобы животное не могло удалить метку во время груминга.
3. Периодически проверяйте маркировку, если вы используете ее в качестве единственного идентификатора более нескольких дней.
4. Хвост также можно использовать в течение короткого времени. Тем не менее, животное может удалить с него отметину во время груминга.

6. Временная идентификация крыс

1. Задержите крысу так, чтобы место нанесения красителя или маркера было легко доступно. В некоторых случаях, когда нужна только полоска или точка, животное не нужно будет удерживать, а позволит свободно передвигаться по клетке.
2. Обычно выполняется ручное удержание путем захвата хвоста и удержания его в напряженном положении во время проведения идентификации.
3. Капризным животным можно проводить временную иммобилизацию с помощью ингаляционных анестетиков.
4. Периодически проверяйте маркировку, если используете этот метод в качестве единственного идентификатора более нескольких дней.

Возможность идентификации отдельных подопытных животных является важным аспектом ведения научных записей и сбора данных. Различие между животными гарантирует, что для предполагаемой экспериментальной процедуры будет использован правильный субъект.

Существует несколько постоянных и временных методов, которые ученые используют для идентификации отдельных лабораторных животных. В этом видео мы обсудим методы нанесения татуировок на хвост взрослого грызуна, пальцы ног новорожденного и пальцы ног взрослого человека. Далее мы коснемся метода размещения микрочипов, который обычно используется у взрослых крыс, а затем универсального метода временной идентификации с использованием нетоксичных красителей.

Прежде чем углубиться в протоколы для этих методов, давайте рассмотрим соображения, преимущества и недостатки каждого из этих методов. Татуировка хвоста полезна во многих исследовательских протоколах, таких как эксперименты с использованием МРТ или эксперименты, в которых животные генетически предрасположены к кожным заболеваниям, включая язвенный дерматит. Еще одним преимуществом татуировок на хвосте является то, что они легко визуализируются без необходимости вручную удерживать животное.

Некоторые экспериментальные протоколы требуют генотипирования новорожденных уже в первый день, что делает необходимым постоянное идентификацию этих щенков. Использование татуировки на пальцах ног позволяет идентифицировать таких животных до тех пор, пока они не станут достаточно большими, чтобы их можно было бирить ушами или прокалывать уши. Хорошей идеей будет нанести аналогичную татуировку на пальце ноги взрослой матери, чтобы она не слишком остро реагировала и чрезмерно ухаживала за новой татуировкой своего щенка. Хотя у использования этого метода есть несколько преимуществ, недостатком является то, что процедура требует навыков, практики, твердой руки и специализированного оборудования.

Следующий рассматриваемый метод постоянной идентификации – микрочипирование. Несмотря на то, что вживление микрочипов является относительно простым процессом, есть несколько факторов, которые ограничивают его полезность. Во-первых, эти чипы имеют размер примерно с большое рисовое зерно и требуют для имплантации иглы 10-12 калибра, что слишком велико для мыши, что ограничивает метод взрослыми крысами. Во-вторых, микрочипы стоят дорого и поэтому не идеальны для идентификации большого количества животных. Наконец, микрочипы не могут быть использованы в экспериментах, связанных с МРТ. Однако, если есть группа ценных животных, таких как племенные животные с уникальной генетикой, которые должны быть постоянно идентифицированы, можно использовать микрочипы.

Последний метод, о котором мы поговорим, — это временная идентификация с помощью нетоксичных маркеров. Нетоксичные маркеры предназначены для окрашивания меха подопытных животных. Этот метод идеально подходит для краткосрочных исследований, которые требуют, чтобы животные были идентифицированы всего в течение нескольких часов или дней, хотя красители могут оставаться видимыми в течение нескольких недель. Некоторые исследователи используют эти маркеры в сочетании с другими методами идентификации, чтобы легко обнаружить конкретных животных в группе.

Теперь, когда мы обсудили предысторию, давайте узнаем о процедурах, начиная с татуировки хвоста. Здесь мы продемонстрируем эту процедуру на взрослых мышах, но то же самое можно применить к отъему и взрослым крысам.

Чтобы свести к минимуму любые опасения или стресс для животных, татуировка хвоста должна выполняться в процедурном кабинете, а не в зоне содержания животных. Перед нанесением татуировки ограничьте мышку с помощью ограничителя чашечки, при этом хвост туго вытяните из отверстия. Фланец присоски удерживается на месте с помощью специальной стеклянной платформы. Затем очистите хвост небольшим количеством разведенного очистителя тканей на ватном тампоне. Этот шаг важен для удаления накипи и мусора, которые могут помешать татуировке. Далее нанесите тканевое масло на кожу хвоста еще одним тампоном. Это сводит к минимуму повреждение тканей, смягчая кожу и обеспечивая смазку для иглы для татуировки. Кроме того, масло растворяет загрязнения, не удаленные в процессе очистки, и предотвращает появление чернил на нетатуированной коже. Теперь вы готовы нанести татуировку.

Когда аппарат выключен, окуните кончик иглы для татуировки, которая является либо ланцетной, либо иглой для подкожных инъекций, в пигмент. Далее активируйте пистолет с помощью ножной педали, поместите инструмент для татуировки на хвост, и поднесите кончик иглы к месту татуировки. Подходить к коже с иглой на 90? и проникают достаточно глубоко в дерму таким образом, чтобы пигмент оставался навсегда. Изменение звука активированной иглы может помочь различить глубину. Делайте короткие ровные штрихи в одном направлении, образуя цифры и буквы. Старайтесь использовать минимальные изгибы и углы при нанесении татуировки.

Чтобы добавить дополнительный пигмент, опустите кончик иглы в резервуар с красителем для каждого одного-двух символов для мышей и каждого одного символа для крыс. Готовую татуировку промокните бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки пигмента. Наличие крови на татуировке или бумажном полотенце указывает на то, что татуировка была сделана слишком глубоко, и поэтому вряд ли будет постоянной. Укрепите тонкие символы дополнительным пигментом, поместив иглу параллельно, а не поверх уже нанесенного пигмента. Тщательно очищайте тату-оборудование после каждого использования, а между клетками следует использовать новую или стерилизованную иглу и свежий запас чернил, чтобы предотвратить передачу заболевания.

Далее мы узнаем, как наносить татуировки на пальцах ног новорожденным и взрослым. Здесь мы продемонстрируем процедуру на мышах, но те же шаги применимы и к крысам.

Новорожденные имеют татуировки на пальцах ног, так как копчик не окостенел, а длина хвоста слишком мала. Кроме того, по мере роста хвоста кожа будет растягиваться, а цифры могут стать искаженными, тусклыми и нечитаемыми. Начните с нанесения пятна зеленой татуировочной пасты на непористую поверхность, такую как алюминиевая фольга. Затем возьмите в руку предварительно отлученного от груди щенка с помощью марлевой салфетки. Расположите ногу между большим пальцем и сгибом указательного пальца, чтобы обнажить выбранные пальцы для нанесения татуировки. Держите стопу близко к пальцам ног так, чтобы выбранный палец ноги имел твердую поверхность позади него, чтобы предотвратить его изгиб.

Теперь окуните кончик ланцета диаметром 4,5 мм в пасту для татуировки. Затем проткните нужный палец в соответствии с заранее определенным кодом. Чтобы обеспечить правильное проникновение, проткните одно и то же место три раза. Проникайте в кожу достаточно, чтобы паста оставила след, но избегайте глубоких протыканий, чтобы палец ноги не кровоточил. Аккуратно промокните новую татуировку марлей, чтобы удалить излишки пасты для татуировки, и верните животное в клетку. Используйте новый ланцет для следующей подстилки. Через сутки после процедуры убедитесь, что татуировка видна.

Когда кормящим щенкам делают татуировку, желательно также сделать татуировку на матери. Это может помешать ей слишком остро реагировать и чрезмерно ухаживать за татуировками своего щенка. Чтобы нанести татуировку на пальце ноги взрослому человеку, опять же, сначала нанесите небольшое пятнышко зеленой пасты для татуировки на алюминиевую фольгу. Затем ограничьте животное с помощью пластикового конуса или ограничителя из плексигласа, который обеспечивает доступ к задним лапам. Вытяните стопу из удерживающего устройства и расположите ступню между большим пальцем и сгибом указательного пальца, чтобы обнажить выбранные пальцы ног для нанесения татуировки.

Теперь окуните кончик 5-миллиметрового ланцета в пасту для татуировки. И, как и раньше, наносите татуировку, протыкая и прокалывая кожу нужного пальца ноги не менее трех раз, чтобы обеспечить правильное проникновение. Затем аккуратно промокните татуировку, чтобы удалить излишки пасты, и верните животное в клетку. Как и в случае с новорожденными, проверьте татуировку через день после процедуры. Если отметина видна на следующий день после нанесения татуировки, она должна оставаться видимой в течение всей жизни животного. Если она тусклая или не видна, то повторите татуировку, как описано ранее.

Следующий метод идентификации, о котором мы поговорим, предполагает вживление микрочипов грызунам. Чип, обычно используемый для маркировки лабораторных животных, представляет собой чип радиочастотной идентификации (RFID). Обычно чип предварительно загружается в иглы, которые затем можно поместить в аппликатор. Для введения чипа используйте трубку из плексигласа, чтобы удерживать животное, убедившись, что вы все еще можете захватить кожу на плечах. Во-первых, наденьте тент на кожу, чтобы получился карман. Затем поместите иглу через кожу, скосите вверх, параллельно позвоночнику, и направите в сторону хвоста. Извлеките микрочип подкожно и извлеките иглу. Сожмите кожу в месте инъекции, чтобы чип не следовал за иглой из кожи. Продолжайте оказывать давление, чтобы обеспечить гемостаз при любом кожном кровотечении. Извлеките животное из удерживающего устройства и отсканируйте чип с помощью считывателя, предоставленного производителем, для подтверждения идентификационного кода.

Наконец, давайте узнаем, как наносить временные красители на грызунов для идентификации. Начнем с мышей. Во-первых, зафиксируйте животное таким образом, чтобы область между лопатками была доступна. Эта часть тела защищена от самостоятельного ухода. Поместите пятно или полоску красителя на шерсть в этой области и поместите животное обратно в клетку.

У крыс следует удерживать животное вручную, схватив за хвост и натянув его. Это гарантирует, что область для нанесения красителя будет легко доступна, будь то голова, плечи или круп. Нанесите пятнышко или полоску красителя на шерсть. Иногда удается наносить нетоксичный краситель, не сдерживая животное. Периодически проверяйте маркировку на этих животных, особенно если вы используете их в качестве единственного идентификатора более нескольких дней.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуры этих различных методов идентификации, давайте посмотрим, как ученые используют их в различных научных исследованиях сегодня.

Использование грызунов в экспериментах по поведению довольно распространено. Здесь исследователи использовали татуировку на хвосте, чтобы навсегда пометить животных, а затем наблюдали за ними в течение нескольких дней в искусственно созданной домашней клетке. Собранные данные выявили различия в поведении, например, в перемещенном расстоянии, между контрольными и экспериментальными животными в течение 10-дневного послеоперационного периода.

В другом поведенческом эксперименте исследователи сделали татуировку пальцев ног у новорожденных и поместили их в записывающий бокс со специальными микрофонами для записи ультразвуковой вокализации. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы изучить различия в частоте криков, то есть количестве вокализаций в минуту, у мышей дикого типа и мышей с дефицитом Shank2 — модель аутизма — в течение 12-дневного неонатального периода и взрослого возраста.

Наконец, как обсуждалось ранее, использование нетоксичного красителя является эффективным способом маркировки животных для краткосрочных экспериментов. Здесь ученых интересовала переходная экспрессия белка плазмы. Поэтому они пометили животных временными маркерами, ввели плазмидную ДНК внутривенно и собрали образец крови через два дня, чтобы определить экспрессию белка с помощью метода вестерн-блоттинга.

Вы только что посмотрели введение JoVE в татуировки, размещение микрочипов и временные методы идентификации лабораторных мышей и крыс. Идентификация животных является основным компонентом ведения документации в исследованиях. Поэтому при выборе подходящего метода идентификации необходимо учитывать множество факторов. Это включает в себя уровень дискомфорта для животного, простоту техники, экспериментальные потребности и, наконец, стоимость, связанную с методом. Как всегда, спасибо за просмотр!