3.4: Калибровочные кривые

1. Создание стандартов: серийные разведения

1. Сделайте концентрированный стоковый раствор стандарта. Как правило, соединение точно взвешивают, а затем количественно переносят в мерную колбу. Добавьте немного растворителя, перемешайте, чтобы образец растворился, затем заполните линию подходящим растворителем.
2. Выполняйте серийные разведения. Возьмите еще одну мерную колбу и наберите необходимое для разведения количество стандартного растворителя, затем заполните до линии растворителем и перемешайте. Обычно производится десятикратное разведение, поэтому для объемной колбы объемом 10 мл добавьте 1 мл предыдущего разведения.
3. Продолжайте по мере необходимости для большего количества разведений, пипетируя из предыдущего раствора, чтобы разбавить его для получения следующего образца. Для хорошей калибровочной кривой необходимо не менее 5 концентраций.

2. Запустите образцы для калибровочной кривой и неизвестного

1. Прогоните образцы с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, чтобы определить инструментальный отклик, необходимый для калибровочной кривой.
2. Снимите показания с первым образцом. Хорошей идеей является запуск выборок в случайном порядке (т.е. не от самого высокого к меньшему или от самого низкого к высокому) в случае каких-либо систематических ошибок. Чтобы получить оценку шума, повторите показания на любом данном образце 3–5 раз.
3. Запустите дополнительные стандартные выборки, повторяя измерения для каждой выборки, чтобы получить оценку шума. Запишите данные, чтобы построить график позже.
4. Запустите неизвестные образцы. Используйте как можно более схожие условия с выполнением стандартов. Таким образом, матрица образца или буфер должны быть одинаковыми, pH должен быть одинаковым, а концентрация должна находиться в диапазоне стандартных прогонов.

3. Построение калибровочной кривой

1. Запишите данные в электронную таблицу и используйте компьютерную программу для построения графика зависимости данных от концентрации. Если для каждой точки были проведены по крайней мере тройные измерения, можно построить полосы погрешности стандартного отклонения этих измерений для оценки погрешности каждой точки. Для некоторых кривых может потребоваться построить график с осью в качестве логарифма, чтобы получить линию. Уравнение, которое управляет калибровочной кривой, обычно известно заранее, поэтому при наличии логарифма в уравнении используется логарифмическая диаграмма.
2. Изучите калибровочную кривую. Выглядит ли это линейно? Есть ли в нем часть, которая выглядит нелинейной (т.е. достигла предела инструментальной реакции)? Чтобы проверить, подгоните все данные под линейную регрессию с помощью программного обеспечения. Если коэффициент детерминации (R²) невысок, удалите некоторые точки в начале или конце кривой, которые не вписываются в линию, и снова выполните линейную регрессию. Недопустимо удалять точки посередине только потому, что они имеют большую планку погрешности. Исходя из этого анализа, решите, какая часть кривой является линейной.
3. На выходе линейного уравнения должно быть уравнение в формате y=mx+b, где m — наклон, а b — y-пересечение. Единицами измерения наклона являются единицы/концентрации по оси y, в этом примере (Рисунок 1) поглощение/μM. Единицами измерения для точки пересечения по оси Y являются единицы измерения по оси Y. Получается коэффициент детерминации (R²). Чем выше R², тем лучше подгонка; идеальная посадка дает R² из 1. Программа также может дать оценку погрешности по уклону и пересечению.

4. Результаты: калибровочная кривая поглощения синего красителя #1

1. Калибровочная кривая для поглощения синего красителя #1 (при 631 нм) показана ниже (Рисунок 1). Отклик линейный от 0 до 10 μМ. При превышении этой концентрации сигнал начинает выравниваться, поскольку отклик выходит за пределы линейного диапазона УФ-ВИД спектрофотометра.
2. Рассчитайте уровень детализации. Исходя из наклона калибровочной кривой, LOD составляет 3*S.D. (шум)/м. Для этой калибровочной кривой шум был получен путем стандартного отклонения повторных измерений и составил 0,021. LOD будет равен 3*0.021/.109=0.58 μM.
3. Рассчитайте LOQ. LOQ составляет 10*S.D. (шум)/м. Для этой калибровочной кривой LOQ равен 10*0,021/0,109 = 1,93 мкМ.
4. Рассчитайте концентрацию неизвестного. Используйте линейное уравнение для вычисления концентрации неизвестного образца. Калибровочная кривая действительна только в том случае, если неизвестное попадает в линейный диапазон стандартных образцов. Если показания слишком высокие, может потребоваться разбавление. В данном примере неизвестный спортивный напиток был разбавлен в соотношении 1:1. Поглощение составляло 0,243, что соответствовало концентрации 2,02 мкМ. Таким образом, конечная концентрация синего красителя #1 в спортивном напитке составила 4,04 μM.

Рисунок 1. Калибровочные кривые для поглощения синего красителя в УФ-ВИД диапазоне. Слева: Поглощение измерялось при различных концентрациях синего красителя #1. Реакция выравнивается после 10 мкМ, когда поглощение превышает 1. Планки погрешностей получены в результате повторных измерений одного и того же образца и являются стандартными отклонениями. Справа: Линейная часть калибровочной кривой подгоняется линией, y=0.109*x + 0.0286. Неизвестные данные отображаются черным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Калибровочные кривые используются для понимания реакции прибора на аналит и для прогнозирования концентрации аналита в образце.

Калибровочная кривая создается путем предварительного приготовления набора стандартных растворов с известными концентрациями анализируемого вещества. Отклик прибора измеряется для каждого из них и строится в зависимости от концентрации стандартного раствора. Линейная часть этого графика может быть затем использована для прогнозирования концентрации образца анализируемого вещества, коррелируя его реакцию с концентрацией.

В этом видео мы познакомимся с калибровочными кривыми и их использованием, демонстрируя подготовку набора стандартов с последующим анализом образца с неизвестной концентрацией.

Для подготовки калибровочной кривой используется набор стандартных растворов. Эти растворы состоят из диапазона концентраций, которые охватывают приблизительную концентрацию анализируемого вещества.

Стандартные растворы часто готовятся с серийным разведением. Серийное разведение выполняется путем предварительного приготовления стокового раствора анализируемого вещества. Затем исходный раствор разбавляют на известную величину, часто на один порядок. Затем новый раствор разбавляется таким же образом, и так далее. В результате получается набор растворов с концентрациями, превышающими несколько порядков.

Калибровочная кривая представляет собой график зависимости инструментального сигнала от концентрации. График стандартов должен быть линейным и может быть согласован с уравнением y=mx+b. Нелинейные части графика должны быть отброшены, так как эти диапазоны концентраций выходят за пределы линейности.

Уравнение линии наилучшего соответствия может быть затем использовано для определения концентрации образца с использованием сигнала прибора для корреляции с концентрацией. Образцы с измерениями, лежащими за пределами линейного диапазона графика, должны быть разбавлены, чтобы находиться в линейном диапазоне.

Предел обнаружения прибора, или минимальное измерение, которое может быть статистически определено по шуму, также может быть рассчитано по калибровочной кривой. Пустой образец измеряется несколько раз. Предел обнаружения обычно определяется как среднее значение пустого сигнала плюс 3-кратное его стандартное отклонение.

Наконец, можно также рассчитать предел количественной оценки. Пределом количественного определения является наименьшее количество анализируемого вещества, которое может быть точно определено количественно. Это вычисляется как 10 стандартных отклонений над пустым сигналом.

Теперь, когда вы изучили основы калибровочной кривой, давайте посмотрим, как подготовить и использовать ее в лаборатории.

Для начала приготовьте концентрированный стоковый раствор стандарта. Точно взвесьте эталон, и переложите его в мерную колбу. Добавьте небольшое количество растворителя и перемешайте, чтобы образец растворился. Затем заполните до линии растворителем. Важно использовать тот же растворитель, что и образец.

Чтобы приготовить нормативы, наберите необходимое количество пипетки в мерную колбу. Затем заполните колбу до линии растворителем, и перемешайте.

Продолжайте делать стандарты, пипетируя из исходного раствора и разбавляя. Для хорошей калибровочной кривой необходимо не менее 5 концентраций.

Теперь прогоните образцы с помощью аналитического прибора, в данном случае УФ-ВИД спектрофотометра, чтобы определить инструментальный отклик, необходимый для калибровочной кривой.

Возьмем измерение по первому эталону. Запускайте стандарты в случайном порядке, на случай каких-либо систематических ошибок. Измерьте каждый стандарт в 3,5 раза, чтобы получить оценку шума.

Измерьте остальные эталоны, повторив измерения для каждого. Запишите все данные.

Наконец, запустите образец. Используйте ту же матрицу образцов и условия измерения, которые использовались для стандартов. Убедитесь, что образец находится в пределах норм и пределов прибора.

Чтобы построить калибровочную кривую, используйте компьютерную программу, чтобы построить график данных в зависимости сигнала от концентрации. Используйте стандартное отклонение повторяющихся измерений для каждой точки данных, чтобы получить планки погрешностей.

Удалите нелинейные части кривой, затем выполните линейную регрессию и определите наиболее подходящую линию. На выходе должно получиться уравнение в виде y = m x + b. Значение R2 рядом с 1 указывает на хорошую посадку.

Это калибровочная кривая для синего красителя #1, измеренная при длине волны 631 нм. Отклик линейный в диапазоне от 0 до 15 мМ.

Рассчитайте концентрацию образца с помощью уравнения наиболее подходящей линии. Поглощение для образца составило 0,141, что соответствовало концентрации 6,02 мМ.

Теперь, когда вы увидели, как калибровочная кривая может быть использована с УФ-ВИД спектрофотометром, давайте рассмотрим некоторые другие полезные приложения.

Калибровочные кривые часто используются в электрохимических приложениях, так как сигнал электрода должен быть откалиброван в соответствии с концентрацией ионов в растворе. В данном примере были собраны данные для ионоселективного электрода для фтора.

Данные о концентрации должны быть нанесены на логарифмическую шкалу для получения линии. Эта калибровочная кривая может быть использована для измерения концентрации фтора в растворе, таком как зубная паста или питьевая вода.

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ, — это метод разделения и анализа, который широко используется в аналитической химии. ВЭЖХ разделяет компоненты смеси в зависимости от времени, необходимого молекулам для прохождения длины хроматографической колонки. Это время варьируется в зависимости от ряда химических свойств молекул.

Элюирование молекул измеряется с помощью детектора, в результате чего составляется хроматограмма. Площадь пика может быть соотнесена с концентрацией с помощью простой калибровочной кривой ряда стандартных растворов, как в этом примере с популярными ингредиентами газировки.

В некоторых случаях, когда матрица раствора мешает измерению растворенного вещества, классическая калибровочная кривая может быть неточной. В этих случаях подготавливается модифицированная калибровочная кривая. Для этого в образец добавляется диапазон стандартных объемов раствора. Создается график преобразования сигнала в концентрацию, где точка пересечения x равна исходной концентрации раствора образца. Для получения более подробной информации об этой технике, пожалуйста, посмотрите научно-образовательное видео JoVE «Метод стандартного сложения».

Вы только что посмотрели введение JoVE в кривую калибровки. Теперь вы должны понять, где используется калибровочная кривая, как ее создать и как использовать для расчета концентраций образцов.

Как всегда, спасибо за просмотр!