$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Калибровочные кривые используются для понимания реакции прибора на аналит и для прогнозирования концентрации аналита в образце.
Калибровочная кривая создается путем предварительного приготовления набора стандартных растворов с известными концентрациями анализируемого вещества. Отклик прибора измеряется для каждого из них и строится в зависимости от концентрации стандартного раствора. Линейная часть этого графика может быть затем использована для прогнозирования концентрации образца анализируемого вещества, коррелируя его реакцию с концентрацией.
В этом видео мы познакомимся с калибровочными кривыми и их использованием, демонстрируя подготовку набора стандартов с последующим анализом образца с неизвестной концентрацией.
Для подготовки калибровочной кривой используется набор стандартных растворов. Эти растворы состоят из диапазона концентраций, которые охватывают приблизительную концентрацию анализируемого вещества.
Стандартные растворы часто готовятся с серийным разведением. Серийное разведение выполняется путем предварительного приготовления стокового раствора анализируемого вещества. Затем исходный раствор разбавляют на известную величину, часто на один порядок. Затем новый раствор разбавляется таким же образом, и так далее. В результате получается набор растворов с концентрациями, превышающими несколько порядков.
Калибровочная кривая представляет собой график зависимости инструментального сигнала от концентрации. График стандартов должен быть линейным и может быть согласован с уравнением y=mx+b. Нелинейные части графика должны быть отброшены, так как эти диапазоны концентраций выходят за пределы линейности.
Уравнение линии наилучшего соответствия может быть затем использовано для определения концентрации образца с использованием сигнала прибора для корреляции с концентрацией. Образцы с измерениями, лежащими за пределами линейного диапазона графика, должны быть разбавлены, чтобы находиться в линейном диапазоне.
Предел обнаружения прибора, или минимальное измерение, которое может быть статистически определено по шуму, также может быть рассчитано по калибровочной кривой. Пустой образец измеряется несколько раз. Предел обнаружения обычно определяется как среднее значение пустого сигнала плюс 3-кратное его стандартное отклонение.
Наконец, можно также рассчитать предел количественной оценки. Пределом количественного определения является наименьшее количество анализируемого вещества, которое может быть точно определено количественно. Это вычисляется как 10 стандартных отклонений над пустым сигналом.
Теперь, когда вы изучили основы калибровочной кривой, давайте посмотрим, как подготовить и использовать ее в лаборатории.
Для начала приготовьте концентрированный стоковый раствор стандарта. Точно взвесьте эталон, и переложите его в мерную колбу. Добавьте небольшое количество растворителя и перемешайте, чтобы образец растворился. Затем заполните до линии растворителем. Важно использовать тот же растворитель, что и образец.
Чтобы приготовить нормативы, наберите необходимое количество пипетки в мерную колбу. Затем заполните колбу до линии растворителем, и перемешайте.
Продолжайте делать стандарты, пипетируя из исходного раствора и разбавляя. Для хорошей калибровочной кривой необходимо не менее 5 концентраций.
Теперь прогоните образцы с помощью аналитического прибора, в данном случае УФ-ВИД спектрофотометра, чтобы определить инструментальный отклик, необходимый для калибровочной кривой.
Возьмем измерение по первому эталону. Запускайте стандарты в случайном порядке, на случай каких-либо систематических ошибок. Измерьте каждый стандарт в 3,5 раза, чтобы получить оценку шума.
Измерьте остальные эталоны, повторив измерения для каждого. Запишите все данные.
Наконец, запустите образец. Используйте ту же матрицу образцов и условия измерения, которые использовались для стандартов. Убедитесь, что образец находится в пределах норм и пределов прибора.
Чтобы построить калибровочную кривую, используйте компьютерную программу, чтобы построить график данных в зависимости сигнала от концентрации. Используйте стандартное отклонение повторяющихся измерений для каждой точки данных, чтобы получить планки погрешностей.
Удалите нелинейные части кривой, затем выполните линейную регрессию и определите наиболее подходящую линию. На выходе должно получиться уравнение в виде y = m x + b. Значение R2 рядом с 1 указывает на хорошую посадку.
Это калибровочная кривая для синего красителя #1, измеренная при длине волны 631 нм. Отклик линейный в диапазоне от 0 до 15 мМ.
Рассчитайте концентрацию образца с помощью уравнения наиболее подходящей линии. Поглощение для образца составило 0,141, что соответствовало концентрации 6,02 мМ.
Теперь, когда вы увидели, как калибровочная кривая может быть использована с УФ-ВИД спектрофотометром, давайте рассмотрим некоторые другие полезные приложения.
Калибровочные кривые часто используются в электрохимических приложениях, так как сигнал электрода должен быть откалиброван в соответствии с концентрацией ионов в растворе. В данном примере были собраны данные для ионоселективного электрода для фтора.
Данные о концентрации должны быть нанесены на логарифмическую шкалу для получения линии. Эта калибровочная кривая может быть использована для измерения концентрации фтора в растворе, таком как зубная паста или питьевая вода.
Высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ, — это метод разделения и анализа, который широко используется в аналитической химии. ВЭЖХ разделяет компоненты смеси в зависимости от времени, необходимого молекулам для прохождения длины хроматографической колонки. Это время варьируется в зависимости от ряда химических свойств молекул.
Элюирование молекул измеряется с помощью детектора, в результате чего составляется хроматограмма. Площадь пика может быть соотнесена с концентрацией с помощью простой калибровочной кривой ряда стандартных растворов, как в этом примере с популярными ингредиентами газировки.
В некоторых случаях, когда матрица раствора мешает измерению растворенного вещества, классическая калибровочная кривая может быть неточной. В этих случаях подготавливается модифицированная калибровочная кривая. Для этого в образец добавляется диапазон стандартных объемов раствора. Создается график преобразования сигнала в концентрацию, где точка пересечения x равна исходной концентрации раствора образца. Для получения более подробной информации об этой технике, пожалуйста, посмотрите научно-образовательное видео JoVE «Метод стандартного сложения».
Вы только что посмотрели введение JoVE в кривую калибровки. Теперь вы должны понять, где используется калибровочная кривая, как ее создать и как использовать для расчета концентраций образцов.
Как всегда, спасибо за просмотр!