Обнаружение бактериофагов в пробах окружающей среды

1. Получите пробу сточных вод или воды, содержащей колифаг.
2. Разбавьте образец в соотношении 1:10 и 1:100 с помощью буфера Tris. Для этого нужно перенести 1,0 мл культуры в 9 мл трис-буфера, а затем произвести второе 10-кратное разведение.
3. Растопите три тюбика мягкого агара (0,7% питательного агара или триптиказного соевого агара на 3 мл пробирки), поместив их в паровую баню или автоклав.
4. Поместите агар на водяную баню при температуре 45-48 °C на 15 минут, чтобы температура агара стабилизировалась до 45 °C.
5. В первую пробирку добавляют 1 мл логарифмической фазы отвара культуры кишечной палочки¹ и 1 мл неразведенного образца.
6. Снимите трубку с водяной бани и аккуратно покачивайте между руками, чтобы перемешать суспензию в течение 2-3 с.
7. Вытрите воду из тюбика бумажным полотенцем и залейте агаром заранее подготовленную чашку Петри, содержащую донный агар (обычный питательный агар или триптиказный соевый агар).
8. Быстро поверните тарелку, чтобы выложить верхний агар. Убедитесь, что агар покрывает всю поверхность.
9. Повторите шаги 5-8 с двумя другими пробирками мягкого агара, используя 1 мл бактерий и 1 мл каждого разбавленного образца (рисунок 2).
После того как
10. агар застынет, переверните чашки Петри и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 48 ч. Сбейте влагу с крышки чашки Петри. Если капля влаги попадет на налет, это приведет к распространению вируса по поверхности агара.
11. После инкубации подсчитайте количество бляшек на каждом разведении (рисунок 3) и рассчитайте концентрацию фага в исходном образце. Запишите любые существенные различия в размере или внешнем виде бляшек.

Рисунок 2. Порядок подготовки бактериального газона с использованием верхнего агара для подсчета колифагов.

Рисунок 3. Фаговые бляшки на бактериальном газоне.

¹Штамм кишечной палочки ATCC 15597 обычно производит наибольшее количество бляшек из образцов сточных вод. Его следует выращивать в течение ночи в колбе Эрленмейера объемом 250 мл, содержащей 100 мл питательного вещества или триптиказного соевого бульона, и инкубировать в условиях встряхивания при 35 °С. За 3 ч до фагового анализа ввести один мл этой культуры в свежую колбу, содержащую 100 мл питательного вещества или триптиказного соевого бульона, и поместить на водяную баню при температуре 35-37 °С. Это гарантирует, что бактерии находятся в логарифмической фазе роста.