Обнаружение бактериофагов в пробах окружающей среды

Вирусы – это инфекционные биологические частицы, которые отвечают за многие заболевания, от простуды и гриппа, до гепатита и ВИЧ.

Вирусы представляют собой биологические частицы, состоящие из генома ДНК или РНК, обернутых в белковую оболочку, известную как капсид, иногда с дополнительной липидной оболочкой. Вирусы не обладают метаболическими или репродуктивными способностями сами по себе и должны вторгаться в живые клетки и захватывать их клеточные механизмы, чтобы создать больше своих копий.

Как прокариотические клетки, такие как бактерии, так и эукариотические клетки, такие как клетки человека, могут быть инфицированы определенными классами вирусов. В частности, бактериофаги — это вирусы, которые заражают бактерии. Например, колифаги – это те фаги, которые инфицируют кишечную палочку, обычную кишечную бактерию, некоторые штаммы которой могут вызывать пищевое отравление, и которая является признаком фекального загрязнения водоснабжения.

Хотя сами фаги обычно не являются патогенными для человека, есть доказательства того, что они являются надежными суррогатными индикаторами для болезнетворных энтеровирусов, которые также передаются фекально, но трудно поддаются анализу. Наличие относительно быстрых и недорогих методов подсчета бактериофагов делает их привлекательным инструментом для оценки фекального загрязнения в пробах окружающей среды.

В этом видео мы познакомимся с принципами перечисления фагов; продемонстрировать протокол количественного определения фагов, известный как анализ бляшек; И, наконец, изучить несколько применений науки об окружающей среде для обнаружения и подсчета фагов и других вирусов.

Бактериофаги, как и все вирусы, должны паразитировать на живых клетках, в данном случае на бактериях, чтобы размножаться.

Фаги делают это, приземляясь и прикрепляясь к поверхности бактериальной клетки и вводя свои генетические материалы в клетку. Оказавшись внутри клетки, вирусный геном реплицируется и белковые компоненты вирусного капсида производятся с использованием биохимического механизма клетки-хозяина. Как только фаговые частицы собраны, они высвобождаются из бактерий, часто путем лизиса хозяина и прорываются наружу, убивая при этом клетку-хозяина.

Широко используемый метод определения концентрации фагов в образце использует эту литическую активность. В этой методике фаг из образца смешивается с бактериями и мягким агаром. Эту смесь высыпают на чашки Петри с обычным агаром в качестве субстрата, а верхний слой образует накладку.

Бактерии находятся в такой высокой концентрации, что образуют сплошную лужайку. Бактерии должны быть получены из культуры, которая находится в логарифмической фазе роста, чтобы гарантировать, что каждая бактерия, которую заражают фаги, жива и позволяет фагу производить потомство.

Когда фаговая частица заражает и лизирует бактерию, фаговое потомство распространяется на близлежащие бактериальные клетки и продолжает инфекцию. Мягкий агар ограничивает диффузию фаговых частиц. В конце концов, образуется область очищения, известная как бляшка.

Если фаг развести до достаточно низкой концентрации, то на бактериальном газоне могут наблюдаться дискретные, отдельные бляшки. Они могут быть подсчитаны и использованы для расчета количества образующих бляшки единиц, или БОЕ, фага на мл исходного образца.

Теперь, когда вы понимаете, как фаги заражают бактерии и как эту активность можно использовать для измерения концентрации фагов, давайте рассмотрим протокол использования анализа бляшек для подсчета фагов в образцах воды из окружающей среды.

За день до проведения анализа инокулируйте колонию E. coli штамма ATCC 15597 в 100 мл соевого бульона триптиказы в колбе Эрленмейера объемом 250 мл. Инкубируйте его с встряхиванием при 35 ? C на ночь.

За 3 ч до анализа внесите 1 мл ночной культуры E. coli в свежий 100 мл бульона. Поместите эту новую культуру на водяную баню при температуре от 35 до 37 °C. Это гарантирует, что бактерии находятся в логарифмической фазе роста на момент начала анализа.

Чтобы начать анализ бляшек, сделайте 10- и 100-кратные последовательные разведения образца воды, используя 9 мл трис-буфера.

С помощью паровой бани растопите три 5-мл пробирки 0,7% мягкого агара, либо триптиказного сои, либо питательного агара. После растапливания поставьте на водяную баню при температуре от 45 до 48 ? C в течение не менее 15 мин, чтобы температура агара упала до 45 °C.

В первую пробирку мягкого агара добавьте 1 мл предварительно приготовленной культуры E. coli в логарифмической фазе и 1 мл неразбавленной пробы воды. Снимите трубку с водяной бани и аккуратно покачивайте между руками в течение 2-3 с, чтобы перемешать суспензию.

Высыпьте мягкий агар на заранее подготовленную чашку Петри триптиказой соевым или питательным агаром. Быстро поворачивайте пластину для распространения, следя за тем, чтобы она покрывала всю поверхность.

Повторите инокуляцию и осаждение для двух других пробирок, используя по 1 мл каждого из разведенных образцов.

Как только верхний агар застынет, переверните посуду и инкубируйте ее при температуре 37 ? C в течение 48 ч.

После инкубации подсчитайте количество казней на каждой пластине. Исходя из подсчета, рассчитайте концентрацию фагов в исходном образце

Например, если из 10-кратного разбавляющего планшета было получено 9 бляшек, то в исходном образце воды их 9 умножить на 10, или 90 БОЕ/мл колифага.

Теперь, когда вы увидели, как проводятся анализы фаговых бляшек, давайте рассмотрим, как можно использовать анализ бляшек для перечисления фагов и других типов вирусов из различных источников.

Методы, основанные на анализе бляшек, могут быть использованы для выделения бактериофага из различных образцов окружающей среды, таких как почва. В этом примере исследователи сначала собрали фаг из почвы с помощью фильтрации. Затем фаг был использован для заражения обычной почвенной бактерии Arthrobacter в анализе бляшек. Фаги были выбраны из отдельных бляшек и нанесены на новые агаровые пластины, а затем покрыты верхним агаром, содержащим бактерии. Концентрация фагов уменьшается по длине полосы, так что могут быть получены дискретные бляшки, вероятно, образованные одним типом фага. Эти отдельные бляшки затем могут быть выбраны для дальнейшего анализа фагов внутри.

Помимо бактериофагов, анализ бляшек может проводиться и с другими вирусами, в том числе такими, как грипп, которые заражают млекопитающих. Для этого клетки млекопитающих сначала выращивают в виде монослоев в чашках для культивирования тканей. Затем среды, содержащие вирусы, добавляются в клетки, чтобы обеспечить инфекцию, прежде чем клетки покрываются иммобилизующей средой, такой как гелеобразная агароза. После инкубационного периода, который может длиться до двух недель, инфицированные клетки фиксируются и окрашиваются, чтобы можно было визуализировать и подсчитать бляшки.

Наконец, в дополнение к образцам, собранным из окружающей среды, анализы бляшек полезны для обнаружения и перечисления вирусов в образцах тканей инфицированных людей. Здесь исследователи получили и гомогенизировали легочные ткани мышей, инфицированных гамма-герпесвирусами. Этот вируссодержащий гомогенат затем был использован для заражения культуры клеток млекопитающих. Затем можно подсчитать количество бляшек, чтобы получить оценку титра вируса в инфицированных тканях легких.

Вы только что посмотрели видео JoVE об обнаружении бактериофагов в образцах окружающей среды. Теперь вы должны понять основы биологии фагов, как проводить анализ бляшек для количественного определения фагов в образце окружающей среды, а также как анализ бляшек может быть использован для изучения фагов и других вирусов в образцах окружающей среды или клинических образцах. Как всегда, спасибо за просмотр!