Введение компаунда III

Иногда различные экспериментальные подходы требуют использования менее распространенных путей введения соединений у грызунов. Внутрикожный, интраназальный и внутричерепной — вот три из таких альтернативных путей, которые биомедицинские исследователи используют в лабораториях сегодня.

Как следует из названия, внутрикожный препарат доставляет соединения во внешние слои дермы. Интраназальное введение раствора в ноздри животного. А внутричерепная предполагает введение иглы непосредственно в мозг грызуна.

Для успешного выполнения этих процедур необходима специальная подготовка. Здесь мы сначала проиллюстрируем соображения по каждому из этих методов, а затем продемонстрируем методы, которые помогут вам изучить процедуры, обеспечивая при этом безопасность животного и успех эксперимента.

Давайте начнем с обсуждения того, когда эти пути обычно используются и что следует иметь в виду, прежде чем приступать к выполнению этих специализированных методов администрирования.

Внутрикожные инъекции используются для доставки предмета в пространство между эпидермисом и дермой Этот путь обычно предназначен для оценки воспаления, диагностики кожного кровотока или аллергических реакций на антиген. Как и при других путях, внутрикожный раствор также должен быть приготовлен с использованием стерильной техники. И он должен быть физиологически буферным, чтобы иметь нейтральный рН, чтобы избежать некроза тканей в месте инъекции. Для этого впрыска часто используется система без ступицы с иглой 25-30 калибра. Данная система помогает в сохранении объема введения, который находится в пределах 50-100 микролитров на одно место инъекции. Введение излишков может привести к некрозу или нежелательной утечке соединения из-за давления.

Интраназальный путь часто выбирают для местной доставки вакцинации или противоотечного спрея, а также системной доставки и доставки ЦНС. Слизистая оболочка, выстилающая носовую полость, имеет богатый запас кровеносных сосудов и нервов, которые обеспечивают быструю системную абсорбцию и прямое нацеливание на ЦНС. Это неинвазивный метод, требующий минимальной подготовки и навыков, и простого оборудования – калиброванной микропипетки и нескольких одноразовых наконечников. Объемы введения крысам не должны превышать 40-100 мкл в 6-10 мкл-каплях. А для мышей максимальный общий объем составляет 24 микролитра в 3-4 микролитра-каплях.

Хотя анестезия не требуется для этой процедуры, она имеет некоторые преимущества по сравнению с интраназальным введением у животных, находящихся в сознании: 1) она способствует правильному размещению соединения в ноздрях, обеспечивая точную дозировку 2) исключает возможность укуса животного дозирующим оборудованием 3) гарантирует, что не будет травмирования носовых тканей животного, глаз, или кожа лица из-за подергивания головы, и 4) животное с меньшей вероятностью будет фыркать и разбрызгивать соединение из ноздрей при введении.

При внутричерепных инъекциях взрослым мышам и крысам используется стереотаксическое оборудование, о котором рассказывается в видеоролике из сборника «Основы нейронауки». Оборудование обеспечивает правильное позиционирование и правильную глубину впрыска. Здесь мы сосредоточимся на внутричерепной доставке у неонатальных мышей и крыс, у которых череп достаточно тонкий, чтобы вводить его непосредственно через него, и может быть слишком хрупким, чтобы поддерживать стереотаксическое устройство. Основными целями этого метода являются доставка фармакологических препаратов ЦНС непосредственно в ЦНС и предотвращение последствий, возникающих при любом системном пути. Калибр иглы, длина и объем введения определяются в зависимости от вида и возраста детенышей. Обратите внимание, что с возрастом животного количество манометра уменьшается, необходимая длина иглы увеличивается, а также увеличивается максимальный рекомендуемый объем введения.

Имея в виду эту справочную информацию, давайте углубимся в процедуры этих методов инъекций. Во-первых, это техника внутрикожного введения. Эту процедуру необходимо проводить у животных, находящихся под наркозом. Посмотрите еще одно видео из этой коллекции, чтобы понять процедуры индукции и поддержания анестезии.

После того, как животное будет обезболито, побрейте место инъекции с помощью электрической бритвы или крема для депиляции. С помощью марли, смоченной в воде, тщательно удалите с участка отстоявшиеся волосы. Затем с помощью другой марлевой салфетки нанесите на выбритый участок раствор антисептика местного действия. Для введения сначала стабилизируйте кожу в месте инъекции, растянув ее между большим и указательным пальцами.

Теперь поместите скос иглы вверх на кожу и аккуратно введите его сразу за скос так, чтобы отверстие было между слоями эпидермиса и дермы. Затем вводите медленно и обратите внимание, что это создает пузырь на коже. Если игла введена слишком глубоко, то пузырь не образуется. После инъекции сделайте паузу, чтобы кожа растянулась и приспособилась, а затем медленно извлеките иглу. Ни в коем случае не тяните поршень назад, так как вы можете втянуть ткань и нанести травму в месте инъекции. Также не стоит вытирать или промокать место инъекции, так как это может привести к утечке введенного вещества. При выполнении нескольких инъекций обязательно расставьте их достаточно широко, чтобы пузырьки не перекрывались друг с другом.

Далее давайте узнаем о процедуре интраназального введения у животных в сознании и под наркозом.

Для бодрствующих животных удерживайте их, загривая кожу на затылке, а затем удерживайте животное в вертикальном положении с обездвиженной головой. Будьте осторожны, не сжимайте грудную клетку, так как это может помешать животному делать достаточно глубокие вдохи, чтобы втянуть жидкость в легкие. С помощью микропипетки введите часть раствора, поместив небольшую каплю жидкости в носовое отверстие. Животное будет вдыхать каплю. Повторяйте этот процесс, чередуя два носовых отверстия до тех пор, пока не будет введен весь вводимый объем. Напомним - общий объем введения не должен превышать 24 мкл и 100 мкл у мышей и крыс соответственно.

Для мышей и крыс под наркозом поместите животное в положение лежа на спине. Такое положение идеально подходит для доставки ЦНС, так как оно обеспечивает лучшее абсорбцию соединения. Поверните голову животного и введите половину состава непосредственно в одну сторону носового отверстия, синхронизируя это с ингаляцией. Затем поверните голову животного в положение для следующего введения. После 2 вдохов или около того введите оставшийся объем во второе носовое отверстие. После полного введения верните животное обратно в клетку.

Далее давайте рассмотрим процедуру внутричерепного введения неонатальным мышам и крысам. Перед началом процедуры поместите клетку с щенками и плотиной на электрическую грелку, установленную на низкий уровень. Убедитесь, что часть клетки находится вне грелки. Это необходимо для предотвращения переохлаждения и, в то же время, позволить плотине отойти от жары, если она того пожелает. Далее выберите игольчатый калибр, соответствующий возрасту животного. Вспомните, игольчатый калибр; длина иглы, которая используется для контроля глубины залегания иглы во время внутричерепного введения; и объем администрирования... Все зависит от возраста и вида животного.

Длина регулируется с помощью защитного кожуха. Чтобы подготовить эту гарду, измерьте правильную иглу относительно ее колпачка и сделайте отметку. Далее поставьте вторую отметку на колпачке, чтобы указать, где она будет разрезана. Расстояние между двумя метками — это желаемая длина иглы. Затем разрежьте колпачок лезвием бритвы. Не используйте ножницы, так как они раздавят колпачок и не дадут чистого ровного среза. Это и есть «игольная гарда». Утилизируйте иглу, используемую для создания защитного кожуха, так как она больше не стерильна, а вместо этого вставьте новую иглу в защитный кожух и убедитесь, что открыта правильная длина. Далее, с помощью другой иглы, прикрепленной к подходящему шприцу, наберите вещество для инъекции. Для этого используется другая игла, потому что размещение в пробке значительно притупляет эти иглы тонкого калибра, что не является идеальным для внутричерепного введения. Затем поместите наполненный шприц на иглу с гардой. Теперь система готова к инъекции.

Для щенков старше 10 дней следует применять ингаляционную анестезию. Щенки в возрасте до 10 дней не нуждаются в анестезии. Чтобы выполнить инъекцию, сначала найдите участок, который находится в 5 мм позади глаза и примерно в 3 мм от средней линии черепа. Далее введите иглу на глубину, разрешенную защитным кожухом иглы. Затем делайте инъекции медленным устойчивым способом, чтобы избежать травмирования мозга. Извлеките иглу немедленно и с большой осторожностью, чтобы не повредить ткани мозга. Наконец, поместите животное обратно в плотину, чтобы обеспечить надлежащее восстановление.

Теперь давайте рассмотрим некоторые эксперименты, проводимые сегодня в лабораториях, в которых используются эти необычные способы введения.

Внутрикожная инъекция часто используется для изучения воспалительной реакции кожи. В этом эксперименте исследователи использовали этот метод для введения аллергена в одно ухо и нейтрального вещества в противоположное ухо предварительно сенсибилизированной мыши. Затем они ввели синий краситель в кровеносную систему животного, чтобы изучить изменения проницаемости сосудов из-за введения аллергена.

Как упоминалось ранее, одним из применений интраназального введения является введение вакцин. Здесь ученые использовали этот путь для доставки генетически модифицированной, живой аттенуированной вакцины против гриппа диким и трансгенным мышам, а также изучили иммунитет слизистых оболочек путем производства определенного типа Т-клеток.

Наконец, в этих биомедицинских исследованиях использовалось внутричерепное введение для имплантации раковых клеток мышам с ослабленным иммунитетом с целью создания модели опухоли мозга человека. Затем эффективность инъекции была проанализирована с помощью системы визуализации in vivo.

Вы уже смотрели видео JoVE о некоторых специальных методах введения соединений у лабораторных мышей и крыс. Теперь вы должны понять, когда эти процедуры полезны, какие соображения вы должны иметь в виду до и во время выполнения этих методов, а также основные процедурные шаги, чтобы гарантировать, что введение оказывает минимальное влияние на здоровье животного и на экспериментальные данные, которые должны быть собраны. Как всегда, спасибо за просмотр!