Выращивание кристаллов для рентгеноструктурного анализа

Монокристалл необходим для определения его структуры. Качество кристалла сильно влияет на качество и точность определения структуры.

Монокристалл — это твердое тело, в котором расположение молекул повторяется во всех трех измерениях. Пространственное расположение атомов в кристаллическом твердом теле может быть определено с помощью рентгеновской кристаллографии. В этом методе чистый кристаллический образец окутывается пучком рентгеновских лучей. Кристалл преломляет рентгеновские лучи по характерной схеме, связанной со структурой кристаллов и молекулярным составом. Если кристалл образуется слишком быстро, молекулы могут быть беспорядочными, примеси могут быть включены в кристалл или вместо одного кристалла могут образоваться два или более слитых кристалла. Поэтому необходимы специализированные методы с акцентом на медленный рост для получения кристаллов достаточного качества для рентгеновской кристаллографии.

В этом видео будут проиллюстрированы желаемые характеристики кристаллов рентгеновского качества, продемонстрирована процедура их выращивания, а также представлены некоторые варианты применения этого метода в химии.

Электроны рассеивают рентгеновские лучи, испуская при ударе сферическую рентгеновскую волну. Если атомы расположены в упорядоченном порядке, конструктивная интерференция между волнами создает характерную дифракционную картину на рентгеновском детекторе. Кристалл вращается внутри луча для сбора дифракционных картин под разными углами. При наличии достаточных дифракционных картин можно получить молекулярную структуру.

Кристаллы рентгеновского качества обычно имеют симметричную форму и гладкие, отражающие свет грани. При рассмотрении под поляризационным микроскопом они будут прозрачными, но большинство из них должны стать темными при вращении на 90°. Это указывает на высокоупорядоченную структуру. Для выращивания этих кристаллов часто используется диффузия жидкость-жидкость. При этом используются два смешивающихся растворителя: растворитель низкой плотности, или осадитель, в котором соединение, подлежащее рекристаллизации, нерастворимо; и растворитель высокой плотности, в котором соединение растворимо. Как правило, объемное соотношение осадителя и растворителя составляет 2:1.

Осадитель низкой плотности наносится слоями на концентрированный раствор соединения в растворителе высокой плотности. Со временем соединение становится менее растворимым, так как осадок смешивается с раствором. Меньшая граница раздела растворителя приводит к более медленной скорости диффузии, что приводит к получению более крупных и чистых кристаллов. Теперь, когда вы понимаете принципы выращивания кристаллов рентгеновского качества, давайте рассмотрим процедуру их выращивания методом диффузии жидкость-жидкость.

Для начала приобретите необходимое оборудование, найденное в текстовом протоколе. Приобретите растворитель для соединения и менее плотный осадок.

Чтобы приготовить фильтр для пипетки, поместите небольшой кусочек Kimwipe в верхнюю часть стеклянной пипетки и осторожно прижмите бумагу к нижней части корпуса пипетки с помощью стержня или стержня другой пипетки, стараясь не проколоть бумагу. Подготовьте два фильтра для пипетки. Поместите одну из них в ЯМР-трубку. При необходимости закрепите узел с помощью лабораторного зажима и кольцевой подставки. Растворите около 10 мг рекристаллизуемого соединения в 0,75 мл растворителя.

Теперь осторожно добавьте раствор для образца в фильтр для пипетки. Прикрепите колбу к верху и медленно сожмите, чтобы раствор попал в ЯМР-трубку, чтобы удалить твердые примеси. Не позволяйте лампе снова расширяться, пока она прикреплена, так как всасывание приведет к смещению фильтровальной бумаги.

Далее извлеките использованный фильтр для пипетки и поместите второй фильтр в ЯМР-трубку. Нанесите пипеткой примерно 1,5 мл осадителя в пробирку. Дайте растворителю пройти через фильтр под действием силы тяжести. Отныне следите за тем, чтобы не тревожить фильтр во время любых манипуляций. После того, как весь осадок профильтруется в пробирку, снимите фильтр и закройте пробирку крышкой. Поместите его в шкаф или другое легко проверяемое место, где он не будет взбалтываться.

По крайней мере, через один день осмотрите пробирки на предмет роста кристаллов. Если кристаллы отсутствуют или кристаллы очень малы, оставьте пробирку с образцом в покое. Если видны кристаллы, проверьте их размер и форму, не нарушая слои растворителя.

Если кристаллы большие, четко очерченные и не сгруппированы вместе, осмотрите кристаллы под микроскопом, чтобы убедиться в их потенциальном рентгеновском качестве. Не извлекайте кристаллы из пробирки до тех пор, пока дифрактометр не будет готов начать сканирование. Если молекулы растворителя включены в кристаллическую структуру, если дать кристаллу высохнуть, это приведет к его деградации. С помощью рентгеновской кристаллографии было подтверждено, что молекулярная структура этих темно-красновато-фиолетовых кристаллов является тетрафенилпорфирином.

Рентгеновская кристаллография является важным аналитическим инструментом в химии и биохимии.

Методы рекристаллизации включают нагревание и охлаждение, диффузию жидкость-жидкость, диффузию пара и медленное испарение. При медленном испарении системы с одним растворителем соединение растворяют в небольшом количестве растворителя и помещают в емкость с небольшим отверстием в крышке. По мере испарения растворителя концентрация увеличивается до тех пор, пока соединение не начнет кристаллизоваться.

Функциональность белков часто связана с их структурой. Тем не менее, белки могут быть очень трудно кристаллизовать. Необходимо разработать специализированные методы для выращивания кристаллов белков рентгеновского качества. Здесь капля белкового раствора смешивается с каплей осадителя и эта смесь запечатывается в камере с чистым осадком. По мере того, как пары растворителя диффундируют из капли, растворимость белка в капле уменьшается, и белок медленно кристаллизуется. Другая методика смешивает раствор белка и осадитель под минеральным маслом. Используя эти методы, можно кристаллизовать различные белки для анализа.

При порошковой дифракции каждая возможная пространственная ориентация представлена в образце одновременно. Порошковая дифракция не так информативна о структуре, как монокристаллическая рентгеновская дифракция, из-за потери трехмерных данных о структуре. Вместо этого порошковая дифракция превосходна в анализе смесей кристаллических твердых тел и оценке кристалличности аморфных структур.

Вы только что посмотрели введение JoVE в выращивание кристаллов для рентгеновской кристаллографии. Теперь вы должны быть знакомы со свойствами кристаллов рентгеновского качества, процедурой их выращивания и некоторыми применениями этого метода в химии.

Спасибо за просмотр!