Внутренние стандарты

1. Правильное обращение с образцами: создание решения

1. Возьмите чистый стакан и намассируйте в него нужное количество пробы. Запишите фактическую использованную массу. В этом примере раствор аденина изготавливают в мерной колбе для использования в качестве внутреннего эталона для следующего анализа. Масса аденина составляет 100 мг. Не перемешивайте непосредственно в мерную колбу, потому что она имеет длинное горлышко и аденин не может быть легко добавлен или удален.
2. Добавьте примерно 25 мл растворителя (в данном случае диметилсульфоксида (ДМСО)) в стакан и дайте ему перемешаться, чтобы он растворился. В этом примере окончательный раствор готовится в мерной колбе объемом 50 мл, поэтому добавьте только около 25 мл для промывки стакана и приготовления раствора до конечного объема.
3. Как только твердое вещество растворится, перелейте раствор в мерную колбу.
4. Промойте стакан и перемешивающую планку небольшим количеством растворителя, около 10 мл, и вылейте ополаскиватель в мерную колбу. Повторите еще дважды. Это помогает обеспечить надлежащую передачу раствора.

2. Подготовка внутренней эталонной калибровочной кривой

1. Подготовьте нужные стандартные образцы для анализа методом газовой хроматографии. В этом примере кофеин экстрагируют из кофе с помощью ацетонитрила, а затем аденин используют в качестве внутреннего стандарта для измерения.
2. Для образцов кофеина взвесьте количество образца, необходимое для получения образца 1 мг/мл. При использовании мерной колбы объемом 10 мл это 10 мг.
3. Взвесьте аналит в стакан, добавьте несколько мл растворителя (в данном случае метанола) для растворения, затем количественно переложите в мерную колбу с помощью 3 полосканий.
4. Приготовьте еще 3 стандарта аналогичным образом с 0,2, 0,5 и 2 мг/мл кофеина.
5. Положите по 1 мл каждого стандарта кофеина во флакон с образцом.
6. Добавьте 0,2 мл 2 мг/мл внутреннего стандарта аденина в каждый флакон с образцом.
7. Проведите эксперимент с газовой хроматографией с каждым стандартом кофеина. Для каждой хроматограммы рассчитайте соотношение пиковых площадей для кофеина по сравнению со стандартным.
8. Постройте график соотношения площади в зависимости от коэффициента концентрации. Наклон этого графика является коэффициентом отклика.

3. Подготовка реального образца с внутренним стандартом для газовой хроматографии

1. Подготовьте нужный образец для анализа методом газовой хроматографии. В этом примере кофеин экстрагируется из кофе с помощью ацетотрила.
2. Для образца кофе смешайте 2 г кофе в стакан объемом 100 мл. Запишите точный вес кофе.
3. Добавьте в стакан 20 мл ацетонитрила.
4. Оставьте на 20 минут, часто помешивая.
5. Отфильтруйте кофейную гущу с помощью фильтровальной бумаги в воронке.
6. Промойте фильтровальную бумагу 3 раза небольшим количеством ацетонитрила (5 мл).
7. Измерьте конечный объем фильтрата. Он должен составлять около 35 мл.

4. Запустите образец и рассчитайте концентрацию

1. Возьмите 1 мл образца кофейного экстракта и добавьте в флакон 0,2 мл внутреннего стандарта. Поместите флакон в штатив для автоматического отбора проб.
2. Выполните анализ образца методом сборки мусора. Убедитесь, что условия ГК таковы, что кофеин и аденин разделяются. В этом примере изотермическое разделение выполняется при температуре 200 °C.
3. После анализа вычислите площадь пика как для внутреннего стандартного пика, так и для пика анализируемого вещества. Используя их соотношения, рассчитайте количество кофеина в пробе.

5. Результаты: GC-анализ кофеина с внутренним стандартом

1. Анализ ГК кофеина показан на рисунке 1. Аденин используется в качестве внутреннего стандарта. Соотношение пиковых площадей может быть измерено и построено на графике в зависимости от отношения концентраций. Наклон графика — это коэффициент отклика (в данном случае 1,8).
2. На рисунке 2 представлена хроматограмма образца кофе с внутренним стандартом аденина. Коэффициент площади пика равен 1,78. Используя фактор отклика и известную концентрацию аденина (0,33 мг/мл), концентрацию кофеина в неизвестном образце рассчитывают как 0,33 мг/мл.

Рисунок 1. График калибровки с использованием внутреннего эталона. График соотношения площади и концентрации для 3 стандартных образцов кофеина (1, 0,5 и 0,2 мг/мл) с добавлением внутреннего стандарта аденина 0,33 мг/мл. Наклон линии равен 1,8, что является коэффициентом отклика.

Рисунок 2. Хроматограмма кофе с адениновым внутренним стандартом. График реакции ФИД-детектора на пробы. Три основных пика — это аденин (IS), кофеин и пальмитиновая кислота.