$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Потеря пробы может происходить при каждой обработке или перемещении пробы, что затрудняет точные расчеты концентрации.
Для обеспечения точности необходимо свести к минимуму последствия потери проб за счет тщательной подготовки проб и ограничения количества этапов обработки и передачи проб. Тем не менее, потеря образца также может произойти из-за систематических ошибок, таких как неполная обработка образца, матричные эффекты и вариации в аналитической процедуре.
Эти источники потерь могут быть объяснены добавлением известной концентрации вида, сходного, но не идентичного, к исследуемому соединению. Это называется внутренним стандартом. Любые потери пробы, которые происходят по сравнению с внутренним стандартом, должны быть одинаковыми для анализируемого вещества, что позволяет точно рассчитать концентрацию.
Это видео проиллюстрирует использование внутреннего стандарта и надлежащей лабораторной методики для учета потерь образца при определении концентрации неизвестного.
Внутренний стандарт — это вещество, добавляемое в известном количестве в стандарты, пробы и заготовки во время анализа.
В хроматографии и спектроскопии рассчитывается соотношение сигнала для внутреннего эталона и анализируемого вещества. Это соотношение, называемое коэффициентом отклика, пропорционально соотношению концентраций аналита и стандарта.
Коэффициент отклика, R, может быть выражен следующим уравнением, где A представляет аналитические сигналы образца и внутреннего стандарта, а C представляет концентрации образца и внутреннего стандарта.
Внутренний стандарт может компенсировать как систематические, так и случайные ошибки. Например, случайные ошибки, такие как несоответствия при измерении образца, будут одинаковыми как для внутреннего стандарта, так и для анализируемого вещества. Поэтому соотношение их сигналов не изменится.
Для систематических ошибок, таких как матричные эффекты в растворе, отношение не будет затронуто, если матричный эффект одинаков как для стандарта, так и для анализируемого вещества.
В то время как внутренние стандарты дают большое преимущество, может быть трудно выбрать тот, который подходит. Внутренний эталон должен иметь сигнал, похожий, но не идентичный анализируемому. Он также никак не может повлиять на измерение аналита.
Наконец, концентрация должна быть хорошо известна. Это достигается за счет того, что внутренний стандарт изначально не присутствует в образце; Таким образом, единственным источником его в растворе является известная добавленная концентрация.
В следующем эксперименте концентрация кофеина в неизвестном образце будет определяться с помощью газовой хроматографии.
Это достигается путем создания калибровочной кривой с использованием известных растворов кофеина с аденином в качестве внутреннего стандарта. Наклон калибровочной кривой равен коэффициенту отклика.
Как только фактор отклика известен, концентрация неизвестного может быть рассчитана на основе измеренного соотношения площади хроматограммы.
Теперь, когда вы разобрались с основами внутренних стандартов, давайте рассмотрим процедуру.
Чтобы начать процедуру, аккуратно взвесьте 100 мг внутреннего стандарта, аденина, в чистую мензурку.
Далее растворите его примерно в 20 мл диметилсульфоксида и перемешайте раствор.
Как только аденин растворится, налейте раствор в мерную колбу объемом 50 мл.
Промойте стакан и перемешайте брусок с 10 мл ДМСО и вылейте ополаскиватель в колбу. Повторите это полоскание дважды, чтобы обеспечить правильное перенос раствора. Заполните до калибровочной метки, в результате чего получите внутренний стандарт с концентрацией 2 мг/мл.
Далее взвесьте в стакан 100 мг кофеина, чтобы приготовить исходный раствор. Растворите кофеин с небольшим количеством метанола. Затем с помощью 3 полосканий перелейте этот раствор в свежую мерную колбу объемом 25 мл. Это исходный раствор в дозе 4 мг/мл. Используйте его для создания 3 стандартов кофеина.
Далее добавьте в каждую колбу по 0,2 мл внутреннего стандарта, аденина. Заполните каждый до конечного объема метанолом. Переложите каждый раствор во флакон с образцом.
Пропустите каждый стандарт кофеина через газовый хроматограф. Рассчитайте соотношение областей пика для кофеина и стандарта аденина.
Сначала взвесьте 2 г кофе в стакан объемом 100 мл и запишите вес.
Затем добавьте 20 мл метанола, чтобы извлечь кофеин из кофе. Дайте раствору помешаться в течение 20 минут.
Используя воронку Бахнера, отфильтруйте кофейную гущу. Промойте стакан небольшим количеством метанола, и вылейте этот ополаскиватель в воронку. Повторите полоскание дважды.
Измерьте конечный объем фильтрата; он должен составлять примерно 35 мл.
Чтобы подготовить образец к анализу, добавьте 1 мл кофейного экстракта во флакон с образцом. Затем добавьте 0,2 мл внутреннего стандарта аденина и поместите флакон в штатив автосэмплера прибора.
Проведите газовый хроматографический анализ образца, убедившись, что условия таковы, что кофеин и аденин отделены друг от друга.
После завершения анализа рассчитайте площадь пика как для внутреннего стандарта, так и для анализируемого вещества.
После того, как все образцы будут проанализированы, можно определить стандартную калибровочную кривую для растворов кофеина/аденина путем построения графика соотношения пиковых областей с соотношением концентраций. Наклон этой линии, представляющий собой коэффициент отклика, составил 1,8.
Далее анализируются данные GC из экстрагированного образца кофе. Соотношение пиковых областей было рассчитано как 1,78. Используя фактор отклика и известную концентрацию внутреннего стандарта, аденина, концентрацию кофеина в неизвестном образце рассчитали как 0,33 мг/мл.
Многие различные типы реакций у разных ученых используют внутренние стандарты для минимизации последствий ошибок и потери пробы.
Последствия потери проб, возникающие во время пробоподготовки, могут быть сведены к минимуму с помощью внутренних стандартов, сохраняя их соотношение концентраций практически постоянным.
В этом примере биологически активные липиды были экстрагированы из лизированных клеток с использованием процесса жидкостно-жидкостной экстракции. Внутренние стандарты стабильных изотопов были добавлены в начале экстракции для учета ошибок при подготовке образцов.
Внутренние стандарты имели решающее значение не только для получения биоактивных липидов, но и для анализа. Липиды были разделены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и проанализированы с помощью масс-спектрометрии.
В спектроскопии внутренние стандарты могут помочь скорректировать случайные ошибки, вызванные изменениями интенсивности источника света. Если лампа или другой источник света имеет переменную мощность, это повлияет на поглощение и, следовательно, излучение образца. Тем не менее, соотношение внутреннего стандарта и анализируемого вещества будет оставаться постоянным, даже если источник света не будет постоянным.
В хроматографии одним из самых больших источников ошибок является инъекция. Автоматические дискретизаторы помогают свести это к минимуму, но погрешность все равно может составлять 1,2% относительного стандартного отклонения.
В этом примере стандарты паров, содержащие внутренний эталон, были проанализированы с помощью газовой хроматографии для установления калибровочной кривой. Как только это будет завершено, можно будет измерить неизвестную выборку и учесть потери, вызванные волатильностью выборки.
Вы только что посмотрели введение JoVE во внутренние стандарты. Теперь вы должны ознакомиться с передовыми методами минимизации потерь проб, внутренними стандартами и коэффициентами реагирования.
Спасибо за просмотр!
