Биораспределение наноносителей лекарств: применение СЭМ
1. Инъекции наночастиц и извлечение органов
- Введите наночастицы в мышь, находящуюся под наркозом, внутривенно, чтобы обеспечить пассивное нацеливание.
- В желаемые сроки, т.е. через 1, 4 и 8 недель, после инъекции, гуманно усыпьте мышей в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA).
- Вскрыть полость тела и хирургическим путем удалить интересующие органы. Поместите органы в 10% фосфатный формалин в полипропиленовый контейнер до подготовки образца.
2. Подготовка образца ткани
- Используйте щипцы для переноса ткани мыши из фиксатора в фосфатно-солевой буфер (PBS). Покачивайте образец в течение 30 минут, заменяя PBS каждые 10 минут.
- Снимите салфетку и высушите кимвайпом. Затем поместите его в пластиковую форму, содержащую компаунд с оптимальной температурой резки (OCT). Хранить при температуре -80 °C в течение ночи.
- На следующий день перенесите образец в криостат и установите температуру на -23 °C.
- Наклейте на предметные стекла информацию о типе органа и размере наночастиц и разместите их на полке в криостате.
- Накройте патрон криостата ОКТ и положите сверху образец. Опустите поршень экстрактора над образцом и дайте ему уравновеситься в течение 3-5 минут.
- Установите патрон на держатель образца и сориентируйте его так, чтобы лезвие могло резать прямо по замороженному образцу. Поднесите образец близко к лезвию для шероховатой облицовки. Установите толщину 30 μм и нарежьте несколько секций, пока не получится равномерно нарезанный ломтик.
- Переход к чистовой наплавке путем уменьшения толщины профиля до 7-8 мкм. Соберите нарезанный срез, нажав на предметное стекло с надписью на срез. Поместите два предметных стекла на каждый предметный предмет и храните на решетке для слайдов. Дайте высохнуть при комнатной температуре.
- После высыхания обезвожьте образцы, погрузив штатив на предметное стекло в 50% этанол на 3 минуты, чтобы удалить ОКТ. Затем переведите решетку на 80% этанол на 3 минуты, прежде чем поместить решетку в соотношение холодного метанола и ацетона 1:1 на 10 минут при -20 °C.
- Снимите решетку для слайдов и слейте излишки растворителя на бумажное полотенце. Через 20–30 минут поместите предметные стекла в коробку для слайдов и храните в морозильной камере при температуре -20 °C до визуализации.
3. Визуализация высокого разрешения с использованием SEM и EDS
- Подготовьте образец, как описано в разделе "SEM Imaging of Biological Samples." Затем загрузите образец в SEM.
- Включите SEM и отрегулируйте рабочее расстояние примерно до 5 мм, а ускоряющее напряжение и ток луча до 25 кэВ, что обычно слишком много для биологического образца. Тем не менее, образец покрывается покрытием для обеспечения проводимости и защиты.
- Начните визуализацию и увеличьте масштаб примерно до 1000-2000-кратного увеличения, чтобы увидеть структуры, которые будут содержать наночастицы. Обратите внимание, что без обнаружения обратного рассеяния (BSD) их невозможно различить ниже определенной глубины.
- Вставьте BSD с теми же параметрами и переместите столик в направлении z на то же рабочее расстояние, что и раньше.
- Начните получать изображения примерно с таким же увеличением и убедитесь, что вы можете видеть высокий контраст в присутствии наночастиц. Сохраните изображения.
- Используйте различные конфигурации BSD (где заряды на детекторе выравниваются), чтобы выбрать ту, которая показывает наибольший контраст для наночастиц.
- Увеличьте высококонтрастную область, показывающую наночастицу или сгусток наночастиц.
- Откройте камеру 2nd камеры камеры и наблюдайте, как вы вставляете EDS в систему, нажимая кнопку вниз на насадке SEM. Когда EDS приблизится, но не коснется BSD или пистолета, отпустите кнопку.
- Откройте программу Aztec на компьютере EDS (все еще на рабочей станции) и получите изображение с помощью SEM. Используйте метод "наведи и снимай", чтобы щелкнуть по области, очень плотной по контрасту и наночастицам.
- EDS покажет спектр характеристических рентгеновских лучей из этой точки. Обратите внимание на пики бария и титана, которые будут определены на графике. Это подтверждает, что то, на что вы смотрите, действительно является наночастицами, а не каким-либо загрязнением.
- Вернитесь к образцу и с помощью программного обеспечения Atlas нанесите на карту границы органа на предметном стекле. Выберите протокол "Organ" для создания мозаичного изображения области и дайте ему запустить (это может занять не более нескольких часов).
- После того, как составное изображение создано и сшито программным обеспечением, экспортируйте его как файл TIF.
- Откройте файл Tif в ImageJ, программном обеспечении с открытым исходным кодом, и отрегулируйте пороговые значения контрастности, чтобы выделить области с очень высоким контрастом (т.е. наночастицы). Используйте встроенные функции для количественной оценки объема наночастиц с использованием размера пикселя, определенного в протоколе Organ (должен быть около 100 нм).
- Хотя эта процедура относится только к образцу легкого мыши за 1 неделю, эта процедура повторяется с образцами из других недель и других органов для составления графика, показывающего распределение.
- После расчета биораспределения для каждого органа за каждую неделю, графики биораспределения покажут изменения в биораспределении и концентрации наночастиц в течение 8 недель. Они показывают пиковую концентрацию, а также предоставляют информацию о том, сколько времени требуется для выведения наночастиц из органа.
Источник: Пейман Шахбейги-Рудпошти и Сина Шахбазмохамади, факультет биомедицинской инженерии, Университет Коннектикута, Сторрс, Коннектикут
Наночастиц…
1. Инъекции наночастиц и извлечение органов
- Введите наночастицы в мышь, находящуюся под наркозом, внутривенно, чтобы обеспечить пассивное нацеливание.
- В желаемые сроки, т.е. через 1, 4 и 8 недель, после инъекции, гуманно усыпьте мышей в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA).
- Вскрыть полость тела и хирургическим путем удалить интересующие органы. Поместите органы в 10% фосфатный формалин в полипропиленовый контейнер до подготовки образца.
2. Подготовка образца ткани
- Используйте щипцы для переноса ткани мыши из фиксатора в фосфатно-солевой буфер (PBS). Покачивайте образец в течение 30 минут, заменяя PBS каждые 10 минут.
- Снимите салфетку и высушите кимвайпом. Затем поместите его в пластиковую форму, содержащую компаунд с оптимальной температурой резки (OCT). Хранить при температуре -80 °C в течение ночи.
- На следующий день перенесите образец в криостат и установите температуру на -23 °C.
- Наклейте на предметные стекла информацию о типе органа и размере наночастиц и разместите их на полке в криостате.
- Накройте патрон криостата ОКТ и положите сверху образец. Опустите поршень экстрактора над образцом и дайте ему уравновеситься в течение 3-5 минут.
- Установите патрон на держатель образца и сориентируйте его так, чтобы лезвие могло резать прямо по замороженному образцу. Поднесите образец близко к лезвию для шероховатой облицовки. Установите толщину 30 μм и нарежьте несколько секций, пока не получится равномерно нарезанный ломтик.
- Переход к чистовой наплавке путем уменьшения толщины профиля до 7-8 мкм. Соберите нарезанный срез, нажав на предметное стекло с надписью на срез. Поместите два предметных стекла на каждый предметный предмет и храните на решетке для слайдов. Дайте высохнуть при комнатной температуре.
- После высыхания обезвожьте образцы, погрузив штатив на предметное стекло в 50% этанол на 3 минуты, чтобы удалить ОКТ. Затем переведите решетку на 80% этанол на 3 минуты, прежде чем поместить решетку в соотношение холодного метанола и ацетона 1:1 на 10 минут при -20 °C.
- Снимите решетку для слайдов и слейте излишки растворителя на бумажное полотенце. Через 20–30 минут поместите предметные стекла в коробку для слайдов и храните в морозильной камере при температуре -20 °C до визуализации.
3. Визуализация высокого разрешения с использованием SEM и EDS
- Подготовьте образец, как описано в разделе "SEM Imaging of Biological Samples." Затем загрузите образец в SEM.
- Включите SEM и отрегулируйте рабочее расстояние примерно до 5 мм, а ускоряющее напряжение и ток луча до 25 кэВ, что обычно слишком много для биологического образца. Тем не менее, образец покрывается покрытием для обеспечения проводимости и защиты.
- Начните визуализацию и увеличьте масштаб примерно до 1000-2000-кратного увеличения, чтобы увидеть структуры, которые будут содержать наночастицы. Обратите внимание, что без обнаружения обратного рассеяния (BSD) их невозможно различить ниже определенной глубины.
- Вставьте BSD с теми же параметрами и переместите столик в направлении z на то же рабочее расстояние, что и раньше.
- Начните получать изображения примерно с таким же увеличением и убедитесь, что вы можете видеть высокий контраст в присутствии наночастиц. Сохраните изображения.
- Используйте различные конфигурации BSD (где заряды на детекторе выравниваются), чтобы выбрать ту, которая показывает наибольший контраст для наночастиц.
- Увеличьте высококонтрастную область, показывающую наночастицу или сгусток наночастиц.
- Откройте камеру 2nd камеры камеры и наблюдайте, как вы вставляете EDS в систему, нажимая кнопку вниз на насадке SEM. Когда EDS приблизится, но не коснется BSD или пистолета, отпустите кнопку.
- Откройте программу Aztec на компьютере EDS (все еще на рабочей станции) и получите изображение с помощью SEM. Используйте метод "наведи и снимай", чтобы щелкнуть по области, очень плотной по контрасту и наночастицам.
- EDS покажет спектр характеристических рентгеновских лучей из этой точки. Обратите внимание на пики бария и титана, которые будут определены на графике. Это подтверждает, что то, на что вы смотрите, действительно является наночастицами, а не каким-либо загрязнением.
- Вернитесь к образцу и с помощью программного обеспечения Atlas нанесите на карту границы органа на предметном стекле. Выберите протокол "Organ" для создания мозаичного изображения области и дайте ему запустить (это может занять не более нескольких часов).
- После того, как составное изображение создано и сшито программным обеспечением, экспортируйте его как файл TIF.
- Откройте файл Tif в ImageJ, программном обеспечении с открытым исходным кодом, и отрегулируйте пороговые значения контрастности, чтобы выделить области с очень высоким контрастом (т.е. наночастицы). Используйте встроенные функции для количественной оценки объема наночастиц с использованием размера пикселя, определенного в протоколе Organ (должен быть около 100 нм).
- Хотя эта процедура относится только к образцу легкого мыши за 1 неделю, эта процедура повторяется с образцами из других недель и других органов для составления графика, показывающего распределение.
- После расчета биораспределения для каждого органа за каждую неделю, графики биораспределения покажут изменения в биораспределении и концентрации наночастиц в течение 8 недель. Они показывают пиковую концентрацию, а также предоставляют информацию о том, сколько времени требуется для выведения наночастиц из органа.
Металлические и магнитные наночастицы широко используются в качестве наноносителей для доставки лекарств. А их биораспределение в тканях имеет важное значение для оценки их терапевтической эффективности и безопасности. Наноносители — это субмикронные частицы, размер которых обычно ограничен менее чем 200 нанометрами, которые могут быть загружены терапевтическими агентами. Благодаря своему размеру они способны получать доступ ко многим участкам и органам в организме. То, где частицы попадают в организм, называется их биораспределением, является важным параметром, используемым для оценки безопасности, оптимизации дозирования и улучшения нацеливания лекарств.
В этом видео будут описаны основные принципы адресной доставки лекарств и продемонстрирован метод оценки биораспределения с использованием методов визуализации с высоким разрешением. Также будут обсуждаться другие применения носителей на основе наночастиц.
Давайте начнем с обсуждения основ наночастиц и разберемся, почему они разрабатываются в качестве носителей лекарств.
Во-первых, наночастицы, которые могут быть полимерными, липосомальными или металлическими, обычно биосовместимы, то есть они не вредны и не реагируют на живые ткани и не вызывают иммунного ответа. Тем не менее, необходимо провести нанотоксикологические исследования, чтобы понять, как материалы и размер частиц влияют на биораспределение в организме.
Во-вторых, их небольшой размер позволяет их экстравазации через эндотелий в очагах воспаления, например, в опухолях, и приводит к эффективному захвату клетками. Когда раковые клетки делятся, сосудистое снабжение необходимо для снабжения питательными веществами и кислородом, а также для поддержки роста опухоли. Эти кровеносные сосуды формируются быстро и поэтому обычно являются аномальными и эффективными, содержат большие пробелы в их эндотелиальной выстилке, что приводит к утечке сосудистой сети и увеличению проницаемости. Затем наночастицы способны улетучиваться из кровотока и накапливаться в микроокружении опухоли. Это называется пассивным нацеливанием, при котором наноноситель достигает органа-мишени посредством явления, известного как эффект ЭПР или эффект повышенной проницаемости и удержания.
Наконец, эти наночастицы имеют большую площадь поверхности, которая может быть функционализирована с помощью специфических лигандов, таких как антитела или белки. При активном нацеливании эти лиганды могут затем распознавать и связываться с рецепторами, которые сверхэкспрессируются клетками в опухолевом участке. Специфические взаимодействия между лигандами на поверхности наноносителя и клеточными рецепторами запускают рецептор-опосредованный эндоцитоз и способствуют его поглощению клетками.
Теперь, когда мы понимаем основы доставки лекарств с помощью наночастиц, давайте посмотрим на демонстрацию, которая использует визуализацию с высоким разрешением для определения биораспределения металлических наночастиц в мышиной модели.
Сначала подготовьте наночастицы, которые будут вводиться в мышь. Здесь были использованы 30-нанометровые частицы бария и титана. После того, как мышь была обезболиваена, введите наночастицы внутривенно через хвостовую вену. Дайте мышам восстановиться, пока они пассивно воздействуют на органы в течение одной, четырех и восьми недель.
В подходящий момент времени после инъекции гуманно усыпьте мышей в соответствии с рекомендациями AVMA. Затем откройте полость тела и хирургическим путем удалите интересующие органы, такие как селезенка, почки, печень и легкие. И храните органы в 10% фосфатно-буферном формалине до анализа.
Теперь с помощью щипцов переведите мышиную ткань из фиксатора в фосфатно-солевой буфер. Покачивайте образец в течение 30 минут, заменяя PBS каждые 10 минут, чтобы удалить излишки фиксатора. Затем извлеките салфетку из шейкера. Добавьте в этикетированную пластиковую форму смесь с оптимальной температурой резки, содержащую водорастворимые гликоли и смолы.
Высушите салфетку с помощью салфетки Kimwipe, а затем поместите ее в пластиковую форму. Заполните форму ОКТ-составом, покрывающим ткань, и поместите в полиэтиленовый пакет. Положите пакет в ведро с сухим льдом и переместите в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию на ночь.
На следующий день достаньте образец из морозилки и поместите на сухой лед во время транспортировки в криостат. Установите температуру в камере на отметке минус 23 градуса, а затем перенесите образец в криостат. Пометьте слайды типом органа и размером наночастиц образца, который вы будете резать. Затем активируйте криостат. Далее накройте патрон криостата ОКТ. Затем извлеките образец из формы и поместите его поверх патрона. Установите патрон на держатель образца, сориентируйте и отрегулируйте его так, чтобы лезвие резало прямо по замороженному образцу. Теперь поднесите образец ближе к лезвию и установите толщину 30 микрометров для шероховатой облицовки. Вращайте маховик, чтобы разрезать срезы толщиной 30 микрометров, и продолжайте резать, пока не будет отрезан ровный срез ткани. Для тонкой облицовки установите толщину сечения на семь-восемь микрометров и разрежьте образец.
Соберите срезы, нажав на предметное стекло с надписью на срезе. Затем добавьте предметные стекла на решетку и высушите на воздухе при комнатной температуре. После высыхания несколько раз окуните решетку для слайдов в 50% этанол на три минуты, чтобы удалить OCT. Переведите решетку на 80% этанол и опустите на три минуты. Затем переставьте решетку на соотношение холодного метанола и ацетона один к одному и поместите в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Через 10 минут достаньте решетку из морозилки и слейте воду с нее на бумажное полотенце. Когда они высохнут, поместите предметные стекла в коробку для слайдов и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования.
Теперь давайте представим изображение легочной ткани мыши, которая была собрана через неделю после инъекции с 30-нанометровыми частицами бария и титана, чтобы определить их биораспределение. Для начала сначала установите подготовленную горку на столик SEM. Чтобы узнать, как распылять шерсть и подготовить образец, посмотрите предыдущее видео из этой коллекции. Затем загрузите столик в камеру SEM. Как только образец окажется в поле зрения, переместите образец вертикально на рабочее расстояние примерно в пять миллиметров. Включите электронный луч и выберите детектор вторичных электронов. Затем установите ускоряющее напряжение луча на 25 килоэлектронвольт. Чтобы начать визуализацию, увеличьте образец до увеличения примерно от 1000 до 2000 раз. При таком увеличении структура, содержащая наночастицы, должна быть видимой, даже если наночастицы таковыми не являются. Это называется вторичным изображением.
Теперь включите режим детектирования электронов обратного рассеяния в модуле SEM для визуализации наночастиц. Переместите столик в направлении Z, чтобы достичь того же рабочего расстояния в пять миллиметров, которое использовалось выше. Отрегулируйте конфигурацию детектора обратного рассеяния и используйте различные смещения напряжения для панелей обнаружения, пока изображение не станет четким. Области с высокой контрастностью, наночастицы, теперь должны быть видны. Это изображение с обратным рассеянием. Захватите и сохраните изображение.
Затем получите данные энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии или EDS образца. Увеличьте высококонтрастную область скопления наночастиц. Затем откройте вторую камеру в камере и опустите ЭДС в систему. Следите за экраном камеры, чтобы убедиться, что EDS приближается, но не касается BSD или электронной пушки. Затем откройте программное обеспечение для микроанализа и получите изображение. С помощью мыши выберите интересующую область для дальнейшего анализа. Затем отображается рентгеновский спектр для этой области. Здесь пики представляют собой барий и титан, подтверждающие наличие металлических наночастиц в образце. Теперь откройте программу для качественного анализа данных и нанесите на карту границы органа на предметном стекле. Затем выберите и запустите соответствующий протокол из меню, чтобы создать мозаичное изображение органа. На это может уйти несколько часов.
После завершения экспортируйте его как файл TIF и откройте файл в ImageJ. Отрегулируйте пороговые значения контраста, чтобы выделить области с очень высокой контрастностью, наночастицы. Затем выберите «Анализировать частицы», чтобы получить среднее количество наночастиц в органе и процентное соотношение площади органа, содержащего наночастицы.
Повторите все шаги этой процедуры для оставшихся образцов тканей из других временных точек и органов. После того, как все данные собраны, скомпилируйте их в граф биораспределения.
Теперь давайте проанализируем изображения, чтобы определить биораспределение и узнать, как организм перерабатывал наночастицы. Сначала построим график измеренного распределения частиц в зависимости от времени для всех анализируемых образцов. Это распределение наночастиц размером 30 нанометров в различных органах мыши с течением времени. Через восемь недель наблюдается общее уменьшение количества наночастиц, что указывает на выведение наночастиц из организма.
Однако через четыре недели наблюдается увеличение концентрации наночастиц в печени. Это говорит о том, что организм может перерабатывать 30-нанометровые наночастицы бария и титана, используемые в этом исследовании, в качестве токсина. Этот анализ также может быть выполнен для оценки того, как размер наночастицы влияет на ее биораспределение в организме. Изменение размера наночастиц влияло на скорость общего поглощения клетками и скорость клиренса.
Наночастицы и наноносители широко используются в биомедицинских исследованиях и применяются в качестве визуализирующих, диагностических и терапевтических агентов. Наночастицы разрабатываются для использования в доставке вакцин против широкого спектра инфекционных заболеваний, поскольку они защищают компоненты вакцины от деградации и максимизируют иммунную стимуляцию. Межбислойные сшитые многослойные везикулы, или ICMV, разрабатываются для индукции антиген-специфических CD8-положительных Т-клеточных ответов.
Эти ICMV специфически локализуются в лимфатических узлах мышей для эффективной доставки вакцины и вызывают устойчивый иммунный ответ против малярийных антигенов и опухолевых клеток. Металлические наночастицы часто используются в качестве контрастных веществ в магнитно-резонансной томографии для визуализации структуры и функции тканей для раннего выявления заболеваний. Наночастицы оксида железа являются полезными диагностическими зондами. При синтезе с бисфосфонатным фрагментом эти наночастицы быстро и избирательно накапливаются в атеросклеротических бляшках и позволяют визуализировать их в течение одного часа для быстрой диагностики.
В последнее время были разработаны загруженные наноносители в качестве стратегии одновременного обнаружения рака на ранних стадиях и доставки химиотерапевтических агентов. Эти наноносители называются тераностикой, потому что они объединяют диагностические и терапевтические способности.
Вы только что посмотрели видео JoVE об определении биораспределения наноносителей лекарств. Теперь вы должны знать основные принципы работы наноносителей лекарств, как обнаруживать наноносители в образцах тканей с помощью СЭМ высокого разрешения и определять их биораспределение, а также некоторые области применения наночастиц в биомедицинской инженерии.
Спасибо за просмотр.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are nanocarriers and why are they used for drug delivery?
Nanocarriers are submicron particles, typically less than 200 nanometers, loaded with therapeutic agents. Their small size enables access to many body sites and organs. Nanocarriers are usually biocompatible, meaning they don't harm living tissue or trigger immune responses. Their large surface area can be functionalized with ligands like antibodies to enable targeted delivery to specific cells.
Q2: How does the EPR effect enable passive targeting of nanoparticles to tumors?
The enhanced permeability and retention effect, or EPR effect, occurs because tumor blood vessels form rapidly and are abnormal with large gaps in their endothelial lining. This leaky vasculature increases permeability, allowing nanoparticles to escape the bloodstream and accumulate within the tumor microenvironment without requiring specific targeting ligands.
Q3: What is the difference between passive and active targeting with nanocarriers?
Passive targeting relies on the EPR effect, where nanoparticles naturally accumulate in tumors through leaky blood vessels. Active targeting uses functionalized nanocarrier surfaces with specific ligands that recognize and bind to receptors overexpressed by tumor cells, triggering receptor-mediated endocytosis for enhanced cellular uptake.
Q4: How is scanning electron microscopy used to visualize nanoparticle biodistribution in tissue samples?
SEM uses backscatter electron detection to visualize metallic nanoparticles as high-contrast regions within tissue sections. Energy dispersive X-ray spectroscopy confirms nanoparticle composition by identifying characteristic X-rays emitted during electron beam interaction. This combination provides high-resolution imaging and increased confidence in detection compared to fluorescence methods.
Q5: What tissue preparation steps are necessary before SEM imaging of nanoparticles?
Organs are fixed in phosphate-buffered formalin, then rinsed in PBS to remove excess fixative. Tissue is embedded in optimal cutting temperature compound and frozen at minus 80 degrees Celsius overnight. Cryostat sectioning produces 7-8 micrometer sections, which are collected on slides and treated with ethanol and acetone to remove OCT before SEM analysis.
Q6: What does nanoparticle biodistribution data reveal about how the body processes metallic nanoparticles?
Biodistribution graphs show nanoparticle concentration in organs over time. An overall decrease after eight weeks indicates clearance from the body. However, increased liver concentration at four weeks suggests the body may process metallic nanoparticles as toxins. Nanoparticle size significantly affects cellular uptake rates and clearance kinetics.
Q7: What are theranostics and how do they combine diagnostic and therapeutic functions?
Theranostics are loaded nanocarriers designed to simultaneously detect early-stage cancer and deliver chemotherapeutic agents. Metallic nanoparticles serve as contrast agents in imaging for tissue visualization, while also functioning as drug carriers. This integration of diagnostic imaging and therapeutic delivery enables both disease detection and treatment in a single platform.
Главы в этом видео
0:07
Overview
1:08
Principles of Nanocarrier Drug Delivery
3:20
Nanoparticle Injection and Organ Harvesting
4:18
Tissue Sample Preparation
6:56
High Resolution Imaging using SEM and EDS
10:16
Results
11:19
Applications
12:59
Summary