Биораспределение наноносителей лекарств: применение СЭМ

1. Инъекции наночастиц и извлечение органов

1. Введите наночастицы в мышь, находящуюся под наркозом, внутривенно, чтобы обеспечить пассивное нацеливание.
2. В желаемые сроки, т.е. через 1, 4 и 8 недель, после инъекции, гуманно усыпьте мышей в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA).
3. Вскрыть полость тела и хирургическим путем удалить интересующие органы. Поместите органы в 10% фосфатный формалин в полипропиленовый контейнер до подготовки образца.

2. Подготовка образца ткани

1. Используйте щипцы для переноса ткани мыши из фиксатора в фосфатно-солевой буфер (PBS). Покачивайте образец в течение 30 минут, заменяя PBS каждые 10 минут.
2. Снимите салфетку и высушите кимвайпом. Затем поместите его в пластиковую форму, содержащую компаунд с оптимальной температурой резки (OCT). Хранить при температуре -80 °C в течение ночи.
3. На следующий день перенесите образец в криостат и установите температуру на -23 °C.
4. Наклейте на предметные стекла информацию о типе органа и размере наночастиц и разместите их на полке в криостате.
5. Накройте патрон криостата ОКТ и положите сверху образец. Опустите поршень экстрактора над образцом и дайте ему уравновеситься в течение 3-5 минут.
6. Установите патрон на держатель образца и сориентируйте его так, чтобы лезвие могло резать прямо по замороженному образцу. Поднесите образец близко к лезвию для шероховатой облицовки. Установите толщину 30 μм и нарежьте несколько секций, пока не получится равномерно нарезанный ломтик.
7. Переход к чистовой наплавке путем уменьшения толщины профиля до 7-8 мкм. Соберите нарезанный срез, нажав на предметное стекло с надписью на срез. Поместите два предметных стекла на каждый предметный предмет и храните на решетке для слайдов. Дайте высохнуть при комнатной температуре.
8. После высыхания обезвожьте образцы, погрузив штатив на предметное стекло в 50% этанол на 3 минуты, чтобы удалить ОКТ. Затем переведите решетку на 80% этанол на 3 минуты, прежде чем поместить решетку в соотношение холодного метанола и ацетона 1:1 на 10 минут при -20 °C.
9. Снимите решетку для слайдов и слейте излишки растворителя на бумажное полотенце. Через 20–30 минут поместите предметные стекла в коробку для слайдов и храните в морозильной камере при температуре -20 °C до визуализации.

3. Визуализация высокого разрешения с использованием SEM и EDS

1. Подготовьте образец, как описано в разделе "SEM Imaging of Biological Samples." Затем загрузите образец в SEM.
2. Включите SEM и отрегулируйте рабочее расстояние примерно до 5 мм, а ускоряющее напряжение и ток луча до 25 кэВ, что обычно слишком много для биологического образца. Тем не менее, образец покрывается покрытием для обеспечения проводимости и защиты.
3. Начните визуализацию и увеличьте масштаб примерно до 1000-2000-кратного увеличения, чтобы увидеть структуры, которые будут содержать наночастицы. Обратите внимание, что без обнаружения обратного рассеяния (BSD) их невозможно различить ниже определенной глубины.
4. Вставьте BSD с теми же параметрами и переместите столик в направлении z на то же рабочее расстояние, что и раньше.
5. Начните получать изображения примерно с таким же увеличением и убедитесь, что вы можете видеть высокий контраст в присутствии наночастиц. Сохраните изображения.
6. Используйте различные конфигурации BSD (где заряды на детекторе выравниваются), чтобы выбрать ту, которая показывает наибольший контраст для наночастиц.
7. Увеличьте высококонтрастную область, показывающую наночастицу или сгусток наночастиц.
8. Откройте камеру 2^nd камеры камеры и наблюдайте, как вы вставляете EDS в систему, нажимая кнопку вниз на насадке SEM. Когда EDS приблизится, но не коснется BSD или пистолета, отпустите кнопку.
9. Откройте программу Aztec на компьютере EDS (все еще на рабочей станции) и получите изображение с помощью SEM. Используйте метод "наведи и снимай", чтобы щелкнуть по области, очень плотной по контрасту и наночастицам.
10. EDS покажет спектр характеристических рентгеновских лучей из этой точки. Обратите внимание на пики бария и титана, которые будут определены на графике. Это подтверждает, что то, на что вы смотрите, действительно является наночастицами, а не каким-либо загрязнением.
11. Вернитесь к образцу и с помощью программного обеспечения Atlas нанесите на карту границы органа на предметном стекле. Выберите протокол "Organ" для создания мозаичного изображения области и дайте ему запустить (это может занять не более нескольких часов).
12. После того, как составное изображение создано и сшито программным обеспечением, экспортируйте его как файл TIF.
13. Откройте файл Tif в ImageJ, программном обеспечении с открытым исходным кодом, и отрегулируйте пороговые значения контрастности, чтобы выделить области с очень высоким контрастом (т.е. наночастицы). Используйте встроенные функции для количественной оценки объема наночастиц с использованием размера пикселя, определенного в протоколе Organ (должен быть около 100 нм).
14. Хотя эта процедура относится только к образцу легкого мыши за 1 неделю, эта процедура повторяется с образцами из других недель и других органов для составления графика, показывающего распределение.
15. После расчета биораспределения для каждого органа за каждую неделю, графики биораспределения покажут изменения в биораспределении и концентрации наночастиц в течение 8 недель. Они показывают пиковую концентрацию, а также предоставляют информацию о том, сколько времени требуется для выведения наночастиц из органа.