$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Микроскопия — это метод, который широко используется для получения изображений детальной структуры образцов. Оптические микроскопы, которые фокусируют свет через ряд линз для увеличения образцов, использовались на протяжении веков, а первый составной микроскоп появился в 17 веке. В это время Антони ван Левенгук был первым, кто наблюдал бактерии, дрожжи, эритроциты и циркуляцию в капиллярных сосудах, внеся значительный научный вклад и проложив путь к микроскопическим достижениям.
Оптические микроскопы до сих пор широко используются в научных исследованиях и клинических условиях для медицинской диагностики. Однако в последние 60 лет появилась конфокальная микроскопия, которая освещает образец через отверстие для увеличения оптического разрешения и контраста.
В этом видео будут проиллюстрированы принципы работы оптической и конфокальной микроскопии, продемонстрирован анализ изображений с высоким разрешением, а также обсуждены некоторые области применения микроскопии в области биомедицинской инженерии.
Начнем с обсуждения основ конфокальной микроскопии. Оптическая микроскопия основана на принципе фокусировки света на образце для получения изображения его детальной структуры. Микроскоп состоит из двух компонентов увеличения; объектив, который фокусирует реальное изображение объекта, и окуляр, который фокусирует увеличенное виртуальное изображение до того, как оно будет получено глазом. Общее увеличение достигается путем умножения увеличений этих двух линз.
Фокусировка света дает заданную плоскость фокусировки, в которой увеличение и свет лампы встречаются в одной точке, что обеспечивает наилучшее разрешение изображения. Когда изображение находится за пределами фокальной плоскости, область освещения больше, и лучи света интерферируют от других частей образца, в результате чего изображение становится размытым. В то время как световые микроскопы освещают и визуализируют весь образец в поле зрения, конфокальный микроскоп использует отверстие для штифта между предметным столиком и детектором, так что только небольшой световой луч фокусируется на одной узкой глубине за раз.
Следовательно, единственной видимой областью образца является точка фокусировки, обеспечивающая хорошо разрешенное изображение. Однако при более высоком разрешении за один раз создается изображение лишь небольшой части этого образца. Перемещая образец в плоскости X-Y, можно выполнить растровое сканирование его поверхности. Для каждой точки сканирования фокусировка оптимизируется путем регулировки высоты Z для доступа к различным фокальным плоскостям. Это обеспечивает максимальное разрешение по точкам образца изображения.
Теперь давайте воспользуемся этими принципами микроскопии и разрешения изображения, чтобы получить изображение мозга мыши с помощью как конфокального, так и оптического микроскопа.
Рассмотрев основные принципы микроскопии, теперь выполним измерение с помощью конфокального микроскопа. Для начала включите микроскоп на компьютерном рабочем месте. Затем загрузите образец на столик и центрируйте его под объективом. Теперь откройте программное обеспечение для работы с изображениями и выберите «Создать новое задание». Перейдите в столбец топографии и выберите кнопку помощника. Выберите наименьшее увеличение, которое для данного микроскопа составляет 2,5x. Затем с помощью манипулятора 3D-микроскопа отрегулируйте Z-положение образца и сфокусируйте его. Нажмите кнопку сбоку так, чтобы по краям появился синий огонек. Это обеспечивает более точное Z-движение и фокусировку. Теперь сделайте обзорное изображение.
Медленно увеличивайте увеличение объектива и регулируйте интенсивность света и фокусировку, чтобы получить желаемое увеличение. Используйте 3D-манипулятор в направлениях X и Y, чтобы выбрать различные области интереса на образце. После того как изображение будет получено с малым увеличением, нажмите кнопку рядом для захвата точки отсчета. Используйте либо точку отсчета по умолчанию, либо укажите новую точку в углу образца, затем нажмите кнопку «Далее». Теперь постепенно меняйте объектив на нужное разрешение для образца. Для этого образца используется 20-кратный объектив для визуализации клеток в тканях мозга мыши. Убедитесь, что есть место для уменьшения рабочего расстояния.
Чтобы определить расстояние для сбора срезов, сначала перейдите на страницу определения диапазона измерения и используйте 3D-манипулятор, чтобы окончательно настроить образец в направлении Z. Нажмите «Установить последним», когда верхняя часть образца находится в фокусе, и нажмите «Установить первым», когда нижняя часть образца находится в фокусе. Убедитесь, что количество вычисляемых срезов не превышает 1 000, иначе программа завершится ошибкой. Убедитесь, что нет красных пикселей, что указывает на перенасыщенность света.
Наконец, нажмите кнопку «Готово», чтобы сделать снимок томографии. Когда программное обеспечение для томографии откроется, выберите вкладку исследований, чтобы просмотреть данные в 3D и выполнить 2D и 3D измерения.
Теперь давайте сделаем изображение с помощью цифрового оптического микроскопа. Сначала включите микроскоп и откройте программное обеспечение для обработки изображений. Затем загрузите образец на столик и центрируйте его под объективом. Когда программное обеспечение для визуализации открыто, выберите задание из списка шаблонов или выберите бесплатную экспертизу. Затем получите обзорное изображение, на котором видна вся сцена. Используйте контроллер для изменения фокуса и положения изображения.
После завершения сбора данных поместите систему координат на изображение. Система координат по умолчанию находится в середине сцены. Для большей гибкости координаты можно изменить вручную.
Затем присвойте образец имя и нажмите кнопку камеры. Нажимайте кнопку реального времени при перемещении по образцу и перемещайте фокус вниз, пока образец не окажется четко сфокусированным. При необходимости используйте вкладку «Освещение и диафрагма» для регулировки освещения. Затем получите изображение образца.
Используйте инструменты на панели оптимизации изображения, такие как наклон объектива, уровни освещения на образце, а также яркость и контрастность изображения, чтобы оптимизировать изображение до желаемой четкости. Теперь коснитесь инструмента «Карандаш», чтобы выполнить измерения. Используйте инструменты расстояния и площади для измерения размера ячеек на образце.
Наконец, перейдите на вкладку рабочего процесса результатов и настройте макет отчета. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить задание для дальнейшего анализа.
Теперь давайте проанализируем изображения мозга мыши, которые были получены с помощью конфокального и цифрового оптического микроскопов. Конфокальное изображение с 50-кратным увеличением имеет высокое разрешение и обеспечивает глубокую фокусировку с различными уровнями глубины информации.
На томографической карте высота этого образца колеблется от одного до девяти микрон. Такие характеристики, как амплитуда, профиль шероховатости и параметры кривой, могут быть дополнительно проанализированы. Тем не менее, весь предметный срез ткани мозга может быть визуализирован с помощью цифрового оптического микроскопа.
Увеличение масштаба среза позволяет получить больше деталей образца, но с гораздо более низким разрешением, чем получено с помощью конфокального микроскопа. Этот образец был получен при 300-кратном увеличении. Специальное программное обеспечение предлагает инструменты для измерения размеров поперечного сечения, таких как диаметр, а также для расчета внутренней площади сечения.
Цифровая, оптическая и конфокальная микроскопия являются стандартными инструментами, используемыми в различных биомедицинских приложениях. Сканирующая лазерная офтальмоскопия или SLO – это неинвазивный метод визуализации, который широко используется в клинической офтальмологии для диагностики и мониторинга развития заболеваний сетчатки.
SLO создает высококонтрастные стереоскопические изображения, которые визуализируют микроглию. Резидентные макрофаги сетчатки, которые участвуют в нескольких заболеваниях сетчатки. Конфокальная микроскопия также используется для визуализации живых клеток, что позволяет исследователям визуализировать микроскопическую функцию биологической клетки в режиме реального времени.
Этот метод используется, в частности, для изучения миграции и пролиферации клеток, а также динамики белков. Здесь трансмембранные рецепторы и лизосомы были помечены флуоресцентными красителями, а их колокализация была проанализирована с помощью покадровой визуализации для изучения интернализации рецепторов.
Вы только что посмотрели введение JoVE в цифровую, оптическую и конфокальную микроскопию. Теперь вы должны понять принципы микроскопии и разрешения изображений, как работать с оптическими и конфокальными микроскопами для получения изображений биологических образцов, а также некоторые применения их использования в области биомедицинской инженерии.
Спасибо за просмотр.
