СЭМ-визуализация биологических образцов

Сканирующая электронная микроскопия, или СЭМ, часто используется для получения изображений биологических материалов в наномасштабе. Оптические микроскопы, которые используют свет для получения изображения образца, активно используются для неразрушающего изображения биологических образцов, однако их разрешение и глубина резкости ограничены, поэтому SEM используется для достижения более высокого разрешения до одного нанометра.

В СЭМ пучок электронов фокусируется через ряд линз конденсора, который затем попадает на образец. Когда луч попадает на образец, электроны на поверхности рассеиваются и измеряются детектором.

В этом видео мы обсудим, как работает SEM, продемонстрируем, как получить изображение биологического образца в лаборатории, и, наконец, познакомим с некоторыми методами, используемыми для получения изображений чувствительных образцов.

В сканирующем электронном микроскопе используется пучок электронов высокой энергии, который генерируется электронной пушкой, оснащенной катодом накаливания. Сгенерированные электроны направляются к аноду, а затем фокусируются с помощью конденсорных линз перед тем, как попасть в линзу объектива. Линза объектива калибруется для фокусировки луча на образце, где он сканируется растром по поверхности. Взаимодействие электронов с атомами в образце используется для изучения топографии, элементного состава и кристалличности образца. Когда падающий электронный пучок попадает на поверхность, он испускает вторичные и обратно рассеянные электроны. Вторичные электроны — это электроны с низкой энергией, которые испускаются образцом близко к поверхности и предоставляют топографическую информацию.

Обратно рассеянные электроны, с другой стороны, отражаются в направлении, противоположном падающему лучу. Интенсивность взаимодействия увеличивается с увеличением атомного веса, что позволяет пользователю различать композиционные различия. При визуализации биологических образцов с помощью SEM необходимо уделять особое внимание, поскольку SEM использует высокий вакуум, поэтому биологические образцы, которые обычно имеют высокое содержание воды, должны быть сначала высушены. Это может привести к коллапсу структуры чувствительных образцов, особенно клеток. Таким образом, клетки обрабатываются фиксатором, промываются, а затем медленно обезвоживаются путем промывания все большим количеством этанола.

Для жестких биологических материалов, таких как коллаген-гидроксиапатитовый тканевый каркас, использованный в данной демонстрации, образец сушат в течение нескольких дней в условиях высокого вакуума.

Наконец, поскольку для типичной СЭМ-визуализации требуется проводящая поверхность, биологические образцы часто покрываются тонким слоем металла перед визуализацией. Теперь, когда мы обсудили, как работает SEM и как подготовить биологический образец для визуализации, давайте рассмотрим, как подготовить и визуализировать тканевый каркас коллаген-гидроксиапатита.

Во-первых, закрепите образец биоматериала на заглушке SEM с помощью проводящей углеродной ленты и убедитесь, что образец сухой и не имеет загрязнений на поверхности.

Затем поместите установленный образец в камеру установки для нанесения покрытий, откачайте камеру и нанесите на образец слой в течение примерно 40 секунд, чтобы получить тонкое покрытие металла толщиной от четырех до шести нанометров, в данном случае золота, с достаточным покрытием. После нанесения покрытия извлеките образец и с помощью проводящей ленты соедините заглушку с верхней частью образца, которая теперь покрыта проводящим металлом.

Наконец, установите заглушку на столик SEM и затяните винт сбоку. Теперь образец готов к нанесению изображения с помощью SEM. Сначала загрузите ступень в камеру SEM и запечатайте дверь, затем нажмите кнопку переноса, чтобы открыть проход из камеры загрузки в вакуум. Как только внутренняя дверца будет открыта, вкрутите металлический стержень в столик и протолкните образец в вакуумную камеру, затем открутите металлический стержень и полностью втяните его в загрузочную камеру, затем нажмите на магазин, чтобы закрыть вакуумную камеру.

Теперь давайте создадим образец с помощью SEM.

Сначала переместите предметный столик с помощью контроллера и переместите образец в поле зрения, затем переместите образец вертикально, пока рабочее расстояние не составит от пяти до 10 миллиметров. Включите электронный пучок и выберите детектор вторичных электронов, установите первоначально пучок на пять килоэлектронвольт, затем увеличьте до 20-30 килоэлектронвольт по мере необходимости. Если изображение нечеткое, поворачивайте ручки фокусировки, яркости и контрастности до тех пор, пока не появится четкое изображение.

Используйте навигацию по рабочей области и направления X и Y, чтобы найти новое место на образце, затем увеличивайте увеличение, пока не станут видны нужные объекты. При необходимости отрегулируйте фокус, контрастность и яркость для улучшения качества изображения. Возможно, вам потребуется уменьшить скорость сканирования и включить усреднение линий, чтобы получить более качественное изображение, а затем сохранить изображение.

Изображения СЭМ показывают высокотрехмерную и пористую структуру с волокнистыми элементами размером менее 25 микрон. Эти особенности было бы трудно визуализировать с помощью оптической микроскопии, так как оптическая микроскопия имеет гораздо меньшую глубину резкости.

Существует множество проблем, связанных с визуализацией биологических структур с помощью СЭМ, включая разрушение структуры или повреждение электронным пучком высоких энергий. Давайте теперь рассмотрим, как общий метод СЭМ применяется к этим типам чувствительных образцов. Хрупкие биологические структуры, такие как эти молодые растительные ткани или ткани с высоким содержанием воды, должны быть обработаны с помощью процесса фиксации перед визуализацией.

Эти цветочные меристемы были немедленно обработаны свежеприготовленным фиксирующим раствором формалина/уксусной кислоты. Неподвижную ткань препарировали в этаноле, помещали в сетчатый контейнер и обезвоживали с помощью этанола серии из 70%, 80%, 90% и 100% этанола. Наконец, растительные ткани были высушены с помощью сушилки для критических точек, смонтированы и покрыты тонким металлическим покрытием.

После СЭМ-визуализации становится ясно, что необработанные структуры были сильно повреждены в процессе сушки и показали значительное разрушение структуры, в то время как те, которые были зафиксированы, сохранили свою естественную структуру. В качестве альтернативы клетки и другие образцы с высоким содержанием воды могут быть визуализированы с помощью СЭМ окружающей среды, или ESEM. ESEM использует высокоэнергетический электронный луч, который сканируется растром над образцом, как и в обычном SEM, однако он позволяет визуализировать влажные или непокрытые образцы, поддерживая газообразную среду внутри камеры.

Это достигается путем отделения высоковакуумной камеры, содержащей электронную пушку, от камеры образца с помощью двух апертур. Электронный пучок действительно несет значительные потери из-за рассеяния молекулами газа, но, как правило, имеет достаточно высокую энергию для визуализации. Здесь клетки были выращены на кремниевом чипе, функционализированном квантовыми точками и зафиксированном с помощью протокола фиксации глутаральдегида. Клетки были изображены в воде и показывают неразрушенную структуру клетки с отдельными квантовыми точками, видимыми на поверхности клетки.

Вы только что посмотрели введение JoVE в визуализацию биоматериалов с помощью SEM. Теперь вы должны понять, как работает SEM, как подготавливаются и визуализируются биологические образцы, а также как применяется этот метод для чувствительных структур.

Спасибо за просмотр!