Анализ клеточного цикла: оценка пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток после стимуляции с помощью окрашивания CFSE и проточной цитометрии

1. Подготовка

1. Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
2. Простерилизуйте все инструменты для вскрытия, сначала с помощью моющего средства, а затем с помощью 70% этанола, а затем тщательно вытрите их насухо.
3. Приготовьте 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальную сыворотку теленка (FCS).

2. Вскрытие

1. Используя систему доставки углекислого газа, усыпьте мышь путем гипоксии. Закрепите усыпленную мышь на диссекционной пластине в положении лежа на спине и проведите продольную лапаротомию с помощью ножниц и щипцов.
2. С помощью щипцов переместите кишечник и желудок с правой стороны живота, чтобы обнажить живот и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку.
3. С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите ее в чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 2% FCS.

3. Выделение иммунных клеток

1. Поместите селезенку на клеточное ситечко 40 мкм над той же чашкой Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее.
2. Перенесите диссоциированную селезенку и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
3. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
4. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл ацетата калия для лизиса эритроцитов. Подождите 2 минуты, а затем доведите объем до 15 мл с помощью HBSS 2% FCS.
5. Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 мин при 10°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS.
6. Подсчитайте клетки с помощью анализа окрашивания трипановым синим цветом и отрегулируйте концентрацию клеток до 10⁷ клеток/мл, используя соответствующий объем HBSS 2% FCS.

4. Окрашивание CFSE и стимуляция Т-клеток

1. Распределите 10⁷ изолированных клеток селезенки/пробирки в 4 пробирках (15 мл пробирок, помеченных от 1 до 4)