5.10: Анализ клеточного цикла: оценка пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток после стимуляции с помощью окрашивания CFSE и проточной цитометрии

1. Подготовка

1. Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
2. Простерилизуйте все инструменты для вскрытия, сначала с помощью моющего средства, а затем с помощью 70% этанола, а затем тщательно вытрите их насухо.
3. Приготовьте 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальную сыворотку теленка (FCS).

2. Вскрытие

1. Используя систему доставки углекислого газа, усыпьте мышь путем гипоксии. Закрепите усыпленную мышь на диссекционной пластине в положении лежа на спине и проведите продольную лапаротомию с помощью ножниц и щипцов.
2. С помощью щипцов переместите кишечник и желудок с правой стороны живота, чтобы обнажить живот и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку.
3. С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите ее в чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 2% FCS.

3. Выделение иммунных клеток

1. Поместите селезенку на клеточное ситечко 40 мкм над той же чашкой Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее.
2. Перенесите диссоциированную селезенку и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
3. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
4. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл ацетата калия для лизиса эритроцитов. Подождите 2 минуты, а затем доведите объем до 15 мл с помощью HBSS 2% FCS.
5. Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 мин при 10°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS.
6. Подсчитайте клетки с помощью анализа окрашивания трипановым синим цветом и отрегулируйте концентрацию клеток до 10⁷ клеток/мл, используя соответствующий объем HBSS 2% FCS.

4. Окрашивание CFSE и стимуляция Т-клеток

1. Распределите 10⁷ изолированных клеток селезенки/пробирки в 4 пробирках (15 мл пробирок, помеченных от 1 до 4)

Для большинства иммунологических исследований измерение пролиферации иммунных клеток является ключевым этапом, и обычно используется метод на основе флуоресцентных красителей CFSE. Правильное деление клеток важно для иммунных клеток, поскольку оно регулирует как уровень, так и специфичность иммунного ответа. Например, Т-клетки размножаются для идентификации и уничтожения раковых клеток, а В-клетки подвергаются делению для производства специфических антител. Общая предпосылка анализа CSFE заключается в окрашивании клеток зеленым флуоресцентным красителем CFSE, который проникает в живые клетки и стабильно связывается с белками внутри, что приводит к постоянному мечению. В результате, когда родительская клетка, содержащая краситель, делится, каждая дочерняя клетка получает половину флуоресценции от родительской клетки.

Этот процесс продолжается в последующих делениях, при этом интенсивность красителя постепенно уменьшается с каждым делением. В нужной конечной точке интенсивность флуоресценции каждой клетки измеряется с помощью проточной цитометрии. Эти данные затем используются для количественной оценки количества и характера делений, через которые прошли клетки. Как показано на рисунке, популяция клеток с самой высокой флуоресценцией относится к родительскому поколению. Второе по старшинству относится ко второму поколению и так далее. Количество пиков определяет количество делений клеток.

Кроме того, если используются первичные иммунные клетки, специфические клеточные популяции, такие как, например, Т-клетки, могут быть помечены флуоресцентным красителем другого цвета вместе с CFSE и одновременно идентифицированы с помощью многоцветной проточной цитометрии. Новые данные могут быть отображены на том же графике, теперь показывающем субпопуляцию Т-клеток с различной интенсивностью окрашивания CFSE, с помощью которой можно конкретно анализировать скорость пролиферации Т-клеток. В этом видео демонстрируется протокол окрашивания CFSE спленоцитов мышей, которые стимулируются антителом к CD3. Затем следует окрашивание для мечения Т-клеток и проточная цитометрия для отслеживания их пролиферации.

Для начала наденьте соответствующую защитную одежду и лабораторные перчатки. Затем вымойте щипцы и ножницы для препарирования сначала моющим средством, а затем 70% этанолом, а затем вытрите их насухо чистым бумажным полотенцем. Приготовьте 50 миллилитров сбалансированного солевого раствора Хэнка, или HBSS, с 2% концентрацией эмбриональной телячьей сыворотки, или FCS, смешав один миллилитр FCS с 49 миллилитрами HBSS в 50-миллилитровой пробирке. Перемешайте, аккуратно пипетируя раствор вверх и вниз примерно 10 раз. Затем изолируют клетки селезенки мыши, как показано в видеопротоколе для выделения FACS В-лимфоцитов селезенки.

Пометьте четыре 15-миллилитровые пробирки от одного до четырех и добавьте один раз по 10 к седьмой изолированной клетке селезенки. Далее добавьте в каждую трубку по три миллилитра HBSS 2% FCS. Затем пипеткой введите один микролитр пяти микромолярных карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира, или CFSE, в каждую пробирку. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 10 минут. Клетки в первой и второй трубах стимулироваться не будут. С их помощью можно будет выявить базальный уровень пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток селезенки.

Внесите пипеткой 10 миллилитров HBSS 2% FCS в эти пробирки. Пробирки 3 и 4 будут стимулироваться антителами к CD3 для наблюдения за их влиянием на клеточный цикл. Добавьте 10 миллилитров HBSS 2% FCS и анти-CD3 антител в конечной концентрации 2,5 мкг на миллилитр в третью и четвертую пробирки. Затем центрифугируйте все пробирки при давлении 370 x g в течение семи минут при температуре 10 градусов Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулы в двух миллилитрах HBSS 2% FCS и пипеткой раздайте полученные растворы в отдельные лунки на шестилуночной пластине. Тщательно промаркируйте табличку от одного до четырех, чтобы отслеживать идентификационные данные образцов. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение трех дней.

На третий день добавьте два миллилитра HBSS 2% FCS в первую и третью лунки, которые должны содержать клетки из первой и третьей пробирок. Энергично проводите пипеткой вверх и вниз, а затем переложите образцы в маркированные пятимиллилитровые пробирки FACS. Поместите планшет с шестью лунками обратно в инкубатор. Эти оставшиеся клетки из второй и четвертой скважин будут проанализированы на пятый день для изучения долгосрочных эффектов стимуляции на клеточный цикл. Центрифугируйте пробирки при давлении 370 x g в течение семи минут при температуре 10 градусов Цельсия, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Теперь добавьте по 100 микролитров смеси антител в каждую пробирку. Инкубируйте трубки в течение 20 минут на льду в темноте. Затем добавьте по одному миллилитру HBSS 2% FCS в каждую пробирку и центрифугируйте пробирки при 370 х г в течение семи минут при 10 градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулы в 200 миллилитрах HBSS 2% FCS и хорошо перемешайте. Переложите ресуспендированные гранулы в новые пробирки с маркировкой FACS.

Затем оцените пролиферацию Т-клеток с помощью проточной цитометрии, как показано в протоколе FACS. Затвор клеток для отбора лимфоидных CD3-положительных клеток и различения CD4-положительных и CD8-положительных клеток, а также для записи данных для первой и третьей пробирок. На пятый день повторите процесс окрашивания клеток из оставшихся двух лунок шестилуночного планшета.

Мы проанализируем влияние стимуляции CD3 на клеточный цикл CD4 и CD8-положительных клеток через три дня и пять дней после стимуляции. Для начала, нажмите на иконку FlowJo и перетащите свои файлы в окно Все образцы. Дважды щелкните по файлу нестимулированных клеток, собранных на третий день, чтобы отобразить точечную диаграмму с прямым рассеянием по оси y и боковым рассеиванием по оси x. Нажмите на многоугольник, чтобы обвести популяции лимфоцитов на основе их морфологии. В окне идентификации субпопуляции назовите популяционные лимфоциты и нажмите OK. Затем дважды кликните по обведенному населению и в новом окне выберите Thy1.2 по оси y и CD3 по оси x. Затем нажмите на многоугольник, чтобы обвести двойные положительные ячейки CD3 и Thy1.2. В новом окне идентификации субпопуляции назовите популяцию T-клеток и нажмите OK. Далее дважды кликните по обведенному населением. В новом окне выберите CD4 по оси y и CD8 по оси x. Затем нажмите на многоугольник, чтобы обвести CD4-положительную популяцию. В новом окне идентификации субпопуляции назовите популяцию CD4 T-клеток и нажмите OK. Теперь нажмите на многоугольник, чтобы обвести CD8-положительную популяцию. В новом окне идентификации субпопуляции назовите популяцию CD8 T-клеток и нажмите OK. Повторите эти шаги с другими файлами.

Чтобы определить частоты делящихся и неделящихся клеток, сначала визуализируйте популяции клеток, нажав на «Редактор макетов». Затем перетащите CD4 Т-клетки и CD8 Т-клетки из каждой из четырех пробирок в окно «Все образцы». Появятся графики, представляющие численность населения. Для каждой пробирки дважды щелкните точечную диаграмму для CD8 Т-клеток и выберите «Гистограмма» в разделе «Определение графика», чтобы визуализировать результаты. Выберите CFSE в качестве параметра для сравнения популяций стимулированных и нестимулированных клеток в каждый момент времени. Неделящиеся клетки поддерживают более высокий уровень CFSE, в то время как пролиферирующие клетки расщепляют содержание CFSE на делящиеся клетки.

Теперь, одновременно нажимая клавишу Shift, дважды кликните по гистограмме. В новом окне нажмите на диапазон и выберите диапазон CFSE, соответствующий наивысшему пику. В окне идентификации субпопуляции назовите популяцию неделящихся CD8 Т-клеток и обозначьте популяцию как делящиеся CD8 клетки. Теперь повторите, чтобы выбрать делящиеся и неделящиеся CD4 Т-клетки в каждой пробирке. Чтобы изучить частоту деления CD3-положительных клеток, нажмите на Редактор таблиц. Затем перетащите интересующие вас популяции «Деление CD8 Т-клеток» и «Деление CD4 Т-клеток» в таблицу. В меню Статистика выберите пункт Частота Т-клеток. Затем нажмите «Создать таблицу», чтобы показать частоту в новой таблице.