Адоптивный перенос клеток: введение донорских спленоцитов мыши мыши-хозяину и оценка успеха с помощью FACS
Источник: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Отделение лимфопоэза, отделение иммунологии, Институт Пасте…
1. Подготовка
- Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
- Простерилизуйте все инструменты для вскрытия, сначала с помощью моющего средства, а затем с помощью 70% этанола, а затем тщательно высушите.
- Приготовьте 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальную сыворотку теленка (FCS).
2. Вскрытие
- Используя систему доставки углекислого газа, усыпьте мышь путем гипоксии. Закрепите усыпленную мышь на диссекционной пластине в положении лежа на спине и проведите продольную лапаротомию с помощью ножниц и щипцов.
- С помощью щипцов перемещают кишечник и желудок с правой стороны живота, чтобы обнажить желудок и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку.
- С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите ее на чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 2% FCS.
3. Выделение иммунных клеток
- Поместите селезенку на клеточное ситечко 40 мкм над чашкой Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее.
- Восстановите прилипшие клетки, промыв поршень и ситечко 1 мл HBSS 2% FCS.
- Перенесите диссоциированную селезенку и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Вымойте чашку Петри 5 миллилитрами HBSS 2% FCS и перелейте жидкость в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
- Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл хлорида калия и аммония пипетом вверх и вниз, чтобы ресуспендировать гранулу и лизировать эритроциты.
- Подождите 2 минуты и добавьте HBSS 2% FCS в ресуспендированную гранулу до получения объема до 14 мл.
- Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 минут при 10°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS путем пипетирования вверх и вниз.
- Подсчитайте клетки с помощью анализа окрашивания трипановым синим и отрегулируйте концентрацию клеток до 107 клеток/мл с использованием соответствующего объема HBSS 2% FCS.
4. Передача усыновления
- Переведите 2 мл полученной клеточной суспензии в пробирку для сбора объемом 5 мл.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл PBS и центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 минут при 10°C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 200 мкл PBS.
- С помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 29G ввести 200 мкл клеточной суспензии экспериментальной мыши внутривенно в ретроорбитальный кровеносный синус.
- В качестве контроля введите второй мыши в ту же кровеносную пазуху 200 мкл фосфатно-солевого буфера.
5. Забор и окрашивание клеток
- Через четыре дня после усыновления усыпьте мышей и удалите селезенку.
- Соберите спленоциты, как описано в разделе 3.
- Перенесите 100 мкл клеточной суспензии от каждой мыши в две пробирки FACS, помеченные как «контрольная» и «перенесенная».
- Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Приготовьте смесь, содержащую четыре антитела в разведениях, перечисленных в таблице Таблица 1.
| Антитела | Флуорохром | Разбавление |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| КД4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
Таблица 1: Состав смеси антител. Приготовление коктейлей из четырех антител с использованием концентрированных антител-флуоресцентных конъюгатов и HBSS.
- Добавьте по 100 мл смеси в каждую пробирку, а затем выдержите 20 минут на льду в темноте.
- Добавьте 1 мл HBSS 2%FCS, а затем центрифугируйте пробирки при 370 x g в течение 3 мин при 10°C.
- Отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулы в 200 мкл HBSS 2% FCS.
- Перенесите ресуспендированные элементы в новые пробирки с маркировкой FACS.
- С помощью проточной цитометрии, как показано в протоколе FACS, оценивают наличие CD45.2-положительных лимфоцитов.
6. Анализ данных
- Откройте программу "FlowJo" и перетащите файлы для каждой трубки в окно "Все образцы".
- Дважды щелкните по файлу "transferred", чтобы отобразить ячейки, записанные из этого образца, на точечном графике, который отображает прямой разброс "SSC-A" по оси Y и боковой разброс "FSC-A" по оси X.
- Нажмите на "polygon" и создайте стратегию стробирования для выбора лимфоцитов, затем различайте донорские и родительские клетки с помощью маркеров клеточной поверхности (CD45.1, CD45.2), а затем характеризуйте популяцию клеток CD45.2+ (CD3, CD4).
- Повторите шаги анализа с файлом "control mouse".
- Чтобы визуализировать популяцию клеток, нажмите на "Layout editor".
- Перетащите популяцию "перенесенные ячейки" и "перенесенные CD4 ячейки" из файлов "transferred" и "контроль" в файлы "Редактор макетов".
- Появится точечная диаграмма, представляющая клетки CD45.2+ и лимфоциты CD4.
- Перенесенные ячейки CD45.2 должны отображаться только на точечной диаграмме "moved mouse".
Адоптивный перенос клеток — это метод введения в организм интересующих клеток. Это мощный метод для изучения различных биологических механизмов, включая действие определенных классов иммунных клеток. Кроме того, адоптивный перенос является многообещающим новым методом лечения многочисленных заболеваний, таких как те, которые требуют трансплантации костного мозга или лечения рака, при котором собственные Т-клетки пациента могут быть извлечены, изменены для распознавания и уничтожения раковых клеток, а затем возвращены в организм для борьбы с опухолями.
В лабораторных условиях животные модели часто используются для изучения адоптивного переноса. Например, у мышей с нокаутом CD45.1 Rag gamma-c отсутствуют фундаментальные рецепторы для многих цитокинов, которые необходимы для нормальной дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток в лимфоциты. В результате, у нокаутных мышей нарушено развитие лимфоцитов и нет естественных киллеров, или NK-клеток, Т-клеток или В-клеток.
Адоптивный перенос может быть использован для введения недостающих иммунных клеток в этих скомпрометированных мышей путем сбора донорской мышиной ткани, содержащей высокие концентрации иммунных клеток, таких как селезенка. Затем ткань диссоциируется и выделяются различные клетки селезенки, включая иммунные клетки. Затем нежелательные эритроциты, или эритроциты, могут быть лизированы путем добавления буфера для лизинга хлорида калия аммония, а оставшиеся лейкоциты, или спленоциты, затем отделяются от клеточного мусора с помощью центрифугирования.
Наконец, очищенные спленоциты вводят мышам с ослабленным иммунитетом, что способствует детальному изучению функций этих клеток. Через несколько дней успех переноса адоптивных иммунных клеток может быть подтвержден путем выделения и подготовки спленоцитов хозяина таким же образом, как и донорской ткани. Затем эти клетки окрашиваются с использованием меченых антител против маркеров иммунных клеток донора, чтобы их можно было проверить и отсортировать с помощью FACS.
Для начала наденьте лабораторные перчатки и соответствующие средства защиты. Затем вымойте щипцы и ножницы для препарирования сначала моющим средством, а затем 70% этанолом, а затем высушите их чистым бумажным полотенцем. Приготовьте 50 миллилитров сбалансированного солевого раствора Хэнка, или HBSS, с 2% фетальной сывороткой для телят, или FCS, смешав один миллилитр FCS с 49 миллилитрами HBSS в 50-миллилитровой пробирке. Перемешайте, аккуратно пипетируя раствор вверх и вниз примерно 10 раз.
Вскрытие усыпленной мыши и удаление селезенки, как показано в видеопротоколе JoVE FACS для разделения В-лимфоцитов селезенки. Чтобы изолировать иммунные клетки, сначала поместите селезенку на клеточный фильтр 40 микрометров в чашке Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее в блюде. Восстановите прилипшие клетки, промыв поршень и ситечко 1 миллилитром HBSS 2% FCS. Затем пипеткой диссоциированную селезенку и жидкость из чашки Петри поместите в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Вымойте чашку Петри с 5 миллилитрами HBSS 2% FCS и перелейте жидкость в 15-миллилитровую трубку.
Центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на g в течение семи минут при 10 градусах Цельсия, а затем осторожно извлекайте пробирку, чтобы не потревожить гранулу. Теперь удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и выбросьте жидкость в соответствующий контейнер для отходов. Затем добавьте два миллилитра буфера для лизинга хлорида калия в центрифужную пробирку и пипеткой вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать гранулу и лизировать эритроциты. Подождите две минуты, а затем добавьте HBSS 2% FCS в ресуспендированную гранулу до получения общего значения 14 миллилитров. Повторите центрифугирование. Осторожно извлеките трубку и выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах HBSS 2% FCS путем пипетирования вверх и вниз. Далее подсчитайте клетки в суспензии. Добавьте пять микролитров трипанового синего к пяти микролитрам клеточной суспензии и хорошо перемешайте с помощью пипетирования. Затем аккуратно нанесите каплю разбавленной клеточной суспензии объемом пять микролитров между покровным стеклом и предметным стеклом Malassez. Установив микроскоп на 40-кратное увеличение, подсчитайте количество ячеек. Отрегулируйте концентрацию клеток от 10 до семи клеток на миллилитр, добавив соответствующий объем HBSS 2% FCS.
Чтобы начать адоптивный перенос, перенесите два миллилитра клеточной суспензии в пятимиллилитровую пробирку для сбора. Центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на g в течение семи минут при 10 градусах Цельсия, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах фосфатного буферного раствора и центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на г в течение семи минут при 10 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах фосфатного буферного раствора. С помощью шприца объемом 0,5 миллилитра с иглой 29-го калибра введите 200 микролитров клеточной суспензии экспериментальной мыши внутривенно в ретроорбитальный кровеносный синус.
Через четыре дня после усыновления усыпьте мышей и удалите селезенку. Затем соберите иммунные клетки, как описано в третьем разделе. Затем перенесите по 100 микролитров клеточной суспензии от каждой мыши в две пробирки FACS, помеченные как контрольные и перенесенные. Центрифугируйте пробирки при 370 умноженных на g в течение семи минут при 10 градусах Цельсия, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Теперь приготовьте смесь, содержащую четыре антитела при разведении, указанном в таблице 1. Добавьте по 100 микролитров смеси в каждую пробирку, а затем выдержите 20 минут на льду в темноте. Затем добавьте по одному миллилитру HBSS 2% FCS в каждую пробирку, а затем центрифугируйте пробирки при 370 умноженных на g в течение трех минут при 10 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах HBSS 2% FCS. Перенесите ресуспендированные элементы в новые меченые пробирки FACS. Теперь используйте проточную цитометрию, как показано в протоколе FACS, для оценки наличия CD45. 2 положительных лимфоцита.
Теперь мы определим наличие лимфоцитов CD45.2, которые были выделены из CD45. 1 селезенка хозяина. Для начала дважды щелкните значок FlowJo и перетащите файлы для каждой трубки в окне всех образцов. Затем дважды щелкните по переданному файлу, чтобы отобразить ячейки, записанные из этого образца, на точечной диаграмме, которая отображает прямое рассеяние FSCA по оси x и боковое рассеяние SSCA по оси y. Нажмите на многоугольник, чтобы обвести популяции лимфоцитов. Появится новое окно идентификации субпопуляции. Нажмите OK. Теперь установите ось Y в положение FSC-W, а ось X в положение FSC-A. Выберите популяцию одной ячейки с помощью инструмента полигона, как показано ранее.
Затем дважды щелкните по обведенной популяции, чтобы создать новое окно для выбранных ячеек. В новом окне выберите CD45.2 на Y и CD45.1 на X. Нажмите на значок T и настройте ось, чтобы увеличить график. Затем нажмите на многоугольник, чтобы обвести положительные клетки CD45.2. В окне идентификации субпопуляции назовите переданные ячейки популяции клеток и нажмите OK. В этом же окне нажмите на прямоугольник, чтобы выбрать отрицательные ячейки CD45.2. В окне идентификации субпопуляции назовите клетки-хозяева популяции клеток и нажмите OK. Далее дважды кликните по обведенному CD45.2 населению, перенесенному населению, чтобы создать новое окно для выбранных ячеек. В новом окне выберите CD3 на Y и CD4 на X.
Затем нажмите на многоугольник, чтобы обвести CD4 положительные клетки CD3. В этом окне идентификации субпопуляции назовите ваши переносимые популяцией клеток CD4. Затем повторите предыдущие шаги анализа с файлом управляющей мыши. Наконец, чтобы визуализировать популяции клеток, нажмите «Редактор макетов». Перетащите перенесенные ячейки и популяцию перенесенных CD4 клеток из переданных и управляющих файлов на вкладку Редактор макетов. Появится точечная диаграмма, представляющая CD45.2-положительные клетки и CD4-лимфоциты. СД45. 2 Перенесенные ячейки должны отображаться только на перенесенной точечной диаграмме мыши.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.