Адоптивный перенос клеток: введение донорских спленоцитов мыши мыши-хозяину и оценка успеха с помощью FACS

1. Подготовка

1. Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
2. Простерилизуйте все инструменты для вскрытия, сначала с помощью моющего средства, а затем с помощью 70% этанола, а затем тщательно высушите.
3. Приготовьте 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальную сыворотку теленка (FCS).

2. Вскрытие

1. Используя систему доставки углекислого газа, усыпьте мышь путем гипоксии. Закрепите усыпленную мышь на диссекционной пластине в положении лежа на спине и проведите продольную лапаротомию с помощью ножниц и щипцов.
2. С помощью щипцов перемещают кишечник и желудок с правой стороны живота, чтобы обнажить желудок и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку.
3. С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите ее на чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 2% FCS.

3. Выделение иммунных клеток

1. Поместите селезенку на клеточное ситечко 40 мкм над чашкой Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее.
2. Восстановите прилипшие клетки, промыв поршень и ситечко 1 мл HBSS 2% FCS.
3. Перенесите диссоциированную селезенку и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. Вымойте чашку Петри 5 миллилитрами HBSS 2% FCS и перелейте жидкость в пробирку объемом 15 мл.
5. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
6. Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл хлорида калия и аммония пипетом вверх и вниз, чтобы ресуспендировать гранулу и лизировать эритроциты.
7. Подождите 2 минуты и добавьте HBSS 2% FCS в ресуспендированную гранулу до получения объема до 14 мл.
8. Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 минут при 10°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS путем пипетирования вверх и вниз.
9. Подсчитайте клетки с помощью анализа окрашивания трипановым синим и отрегулируйте концентрацию клеток до 10⁷ клеток/мл с использованием соответствующего объема HBSS 2% FCS.

4. Передача усыновления

1. Переведите 2 мл полученной клеточной суспензии в пробирку для сбора объемом 5 мл.
2. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
3. Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл PBS и центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 минут при 10°C.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 200 мкл PBS.
5. С помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 29G ввести 200 мкл клеточной суспензии экспериментальной мыши внутривенно в ретроорбитальный кровеносный синус.
6. В качестве контроля введите второй мыши в ту же кровеносную пазуху 200 мкл фосфатно-солевого буфера.

5. Забор и окрашивание клеток

1. Через четыре дня после усыновления усыпьте мышей и удалите селезенку.
2. Соберите спленоциты, как описано в разделе 3.
3. Перенесите 100 мкл клеточной суспензии от каждой мыши в две пробирки FACS, помеченные как «контрольная» и «перенесенная».
4. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
5. Приготовьте смесь, содержащую четыре антитела в разведениях, перечисленных в таблице Таблица 1.

Антитела	Флуорохром	Разбавление
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
КД4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Таблица 1: Состав смеси антител. Приготовление коктейлей из четырех антител с использованием концентрированных антител-флуоресцентных конъюгатов и HBSS.

6. Добавьте по 100 мл смеси в каждую пробирку, а затем выдержите 20 минут на льду в темноте.
7. Добавьте 1 мл HBSS 2%FCS, а затем центрифугируйте пробирки при 370 x g в течение 3 мин при 10°C.
8. Отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулы в 200 мкл HBSS 2% FCS.
9. Перенесите ресуспендированные элементы в новые пробирки с маркировкой FACS.
10. С помощью проточной цитометрии, как показано в протоколе FACS, оценивают наличие CD45.2-положительных лимфоцитов.

6. Анализ данных

1. Откройте программу "FlowJo" и перетащите файлы для каждой трубки в окно "Все образцы".
2. Дважды щелкните по файлу "transferred", чтобы отобразить ячейки, записанные из этого образца, на точечном графике, который отображает прямой разброс "SSC-A" по оси Y и боковой разброс "FSC-A" по оси X.
3. Нажмите на "polygon" и создайте стратегию стробирования для выбора лимфоцитов, затем различайте донорские и родительские клетки с помощью маркеров клеточной поверхности (CD45.1, CD45.2), а затем характеризуйте популяцию клеток CD45.2⁺ (CD3, CD4).
4. Повторите шаги анализа с файлом "control mouse".
5. Чтобы визуализировать популяцию клеток, нажмите на "Layout editor".
6. Перетащите популяцию "перенесенные ячейки" и "перенесенные CD4 ячейки" из файлов "transferred" и "контроль" в файлы "Редактор макетов".
7. Появится точечная диаграмма, представляющая клетки CD45.2⁺ и лимфоциты CD4.
8. Перенесенные ячейки CD45.2 должны отображаться только на точечной диаграмме "moved mouse".