What is the difference between Gram-positive and Gram-negative bacteria?

Gram-positive bacteria have a thick peptidoglycan layer that retains crystal violet stain, appearing dark purple. Gram-negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and higher lipid content, so they lose the purple stain during decolorization and are counterstained red by safranin, which binds to their lipopolysaccharide layer.

Why is heat-fixing used in Gram staining but not in capsule staining?

Heat-fixing adheres bacterial cells to the slide and makes them more readily accepting of stains in Gram staining. However, heat-fixing is avoided in capsule staining because it can disrupt or dehydrate the capsule, causing false negatives, and can shrink cells, creating a clearing that mimics a capsule and causes false positives.

How does capsule staining reveal bacterial capsules?

Capsule staining uses negative staining, applying an acidic colorant like Congo red to stain the background and bacterial cells, while leaving capsules unstained. The capsule appears as a clear halo around the purple-stained bacterial cells against the dark background, making it visible under light microscopy.

What are endospores and why are they difficult to stain?

Endospores are dormant, tough, non-reproductive structures that bacteria produce under adverse conditions like extreme temperatures or dehydration to ensure survival. They are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to most dyes, requiring specialized methods like the Schaeffer-Fulton technique with malachite green and heat.

What colors result from endospore staining and what do they indicate?

In endospore staining, vegetative cells appear pinkish-red after safranin counterstaining, while endospores retain the malachite green stain and appear bluish-green. These distinct colors allow differentiation between spore-forming and non-spore-forming bacteria and confirm the presence of spores in a sample that could lead to bacterial contamination.

How can Gram staining be used to identify bacterial morphology and arrangement?

After Gram staining, bacterial cells can be observed under light microscopy to determine their shape and arrangement. Cocci are round bacteria, while bacilli are rod-shaped. Bacteria may arrange as single cells, pairs, chains, or clusters, and these morphological features aid in bacterial classification and identification.

Why is negative staining necessary for capsule visualization?

Capsules have a non-ionic composition and tend to repel stains, making simple staining methods ineffective. Negative staining works by coloring the background and cells while leaving the capsule unstained, creating contrast. This approach avoids heat-fixing, which could damage the capsule and produce false results when using pure cultures and streak plating isolation of single bacterial colonies.

Микроскопия и окрашивание: окрашивание по Граму, капсулам и эндоспорам

0 просмотров11:33 мин

1. Окрашивание по Граму

Настройка
1. Наденьте перчатки и негорючий лабораторный халат, так как красители могут испачкать руки и одежду.
2. Горелка Бунзена используется для термофиксации бактерий. Соблюдайте осторожность при работе с пламенем; Завяжите назад длинные волосы.
3. Будут использоваться коммерчески доступные реагенты для окрашивания по Граму.
4. Очистите предметные стекла микроскопа лабораторными салфетками.
Протокол
1. Нанесите на предметное стекло 10 мкл фосфатно-солевого буфера или питательного бульона.
2. Нанесите в жидкость колонию бактерий, чтобы получить тонкий, ровный слой.
  Примечание: Не используйте культуры старше 24 часов, так как слишком старые бактерии могут иметь изменения в своей клеточной стенке, что повлияет на результаты окрашивания по Граму (1, 4).
3. Полностью высушите горку на воздухе.
4. После высыхания зафиксируйте бактерии, пропустив их через пламя (бактерия стороной вверх) 4-5 раз.
  Примечание: Не держите предметное стекло в пламени слишком долго, иначе вы можете исказить бактериальные клетки (1).
5. Работая над раковиной, удерживайте горку на одном уровне и нанесите Gram's Crystal Violet, чтобы полностью покрыть тепло зафиксированные бактерии, дайте постоять 45 секунд.
6. Смойте излишки Crystal Violet, удерживая предметное стекло под углом и распыляя на предметное стекло слабую непрямую струю воды, позволяя ей стекать по испачканным бактериям. Не распыляйте воду непосредственно на бактерии.
7. Удерживая слайд еще раз, нанесите раствор йода Грама, чтобы полностью покрыть испачканные бактерии, дайте постоять 45 секунд.
8. Смойте излишки йода, как описано в пункте 1.2.6 выше.
9. Удерживая предметное стекло под углом, добавьте несколько капель обесцвечивателя на предметное стекло, позволяя ему стекать вниз по окрашенным бактериям до тех пор, пока сток не станет прозрачным; Как правило, около 5 секунд. Немедленно промойте водой, как в пункте 1.2.6 выше.
  Примечание: Это критический шаг в протоколе. Если позволить обесцвечивателю просачиваться слишком долго или недостаточно долго, это приведет к ложному окрашиванию по Граму (4).
10. Удерживая горку еще раз, нанесите сафранин Грэма, чтобы полностью покрыть бактерии, дайте постоять 45 секунд.
11. Промойте излишки сафранина, как описано в пункте 1.2.6 выше.
12. Промокните, не втирайте, лишнюю воду с горки с помощью бумажных полотенец.
13. Исследуйте предметное стекло на микроскопе с помощью масляной иммерсии со 100-кратным объективом.
Результаты и анализ данных
1. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
2. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
3. Будет видна форма (кокки, бациллы, изогнутые палочки, спирали) бактерий.
4. Будет видно расположение бактериальных клеток (одиночные клетки, парные клетки, цепочки клеток, кластеры, группировки).

2. Окрашивание капсул

Настройка
1. Наденьте перчатки и лабораторный халат, так как красители пачкают руки и одежду.
2. Чтобы приготовить 1% раствор Crystal Violet, смешайте 0,25 грамма Crystal Violet с 25 мл дистиллированной воды до полного растворения.
3. Чтобы приготовить 1% раствор Congo Red, смешайте 0,25 грамма Congo Red с 25 мл дистиллированной воды до полного растворения.
4. Очистите предметные стекла лабораторными салфетками.
Протокол
1. Нанесите 10 μL Congo Red на предметное стекло.
2. С помощью наконечника пипетки нанесите колонию бактерий на краситель, чтобы получить тонкий ровный слой.
3. Полностью высушите горку на воздухе смесью красителей и клеток, 5-7 минут.
  Примечание: Не нагревайте, так как нагревание может обезвоживать или деформировать капсулу.
4. Залейте мазок 1% Crystal Violet на 1 минуту.
5. Промойте излишки пятна, удерживая предметное стекло под углом и распыляя на предметное стекло слабую непрямую струю воды, позволяя ей стекать по испачканным бактериям. Не распыляйте воду непосредственно на бактерии.
6. Удерживайте предметное стекло под углом 45 градусов до полного высыхания на воздухе.
7. Исследуйте мазок на микроскопе под действием масляной иммерсии с объективом 100X.
Результаты и анализ данных
1. Бактериальные клетки окрашиваются в фиолетовый цвет.
2. Фон слайда будет окрашен в темный цвет.
3. Капсулы будут представлять собой четкий ореол вокруг клеток на темном фоне.

3. Окрашивание эндоспор (метод Шеффера-Фултона)

Set-up
1. Наденьте перчатки и негорючий лабораторный халат, чтобы защитить руки и одежду от красителей и пламени.
2. Горелка Бунзена используется для нагрева и фиксации бактерий. Соблюдайте осторожность при работе с пламенем; Завяжите назад длинные волосы.
3. Для приготовления 0,5% раствора Малахитового зеленого смешайте 0,125 грамма Малахитового зеленого с 25 мл дистиллированной воды до полного растворения.
4. Используйте коммерчески доступный раствор реагента Gram's Safranin.
5. Очистите предметные стекла лабораторными салфетками.
Протокол
1. Нанесите 10 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) или культуральный бульон на предметное стекло.
2. Используя асептический метод, нанесите колонию бактерий в жидкость, чтобы получить тонкий, ровный слой.
  Примечание: Эндоспоры обычно не образуются в молодых клетках; Таким образом, рекомендуется проводить бактериологическое исследование в возрасте от 18 до 36 часов (9).
3. Полностью высушите горку на воздухе.
4. Зафиксируйте теплом, пропустив предметное стекло (бактериальной стороной вверх) через пламя 4-5 раз.
5. Чтобы удержать краситель, положите лист бумаги для линз (разрезанный по размеру бактериального мазка) поверх термофиксированного мазка.
6. Пропитайте пленочную бумагу раствором Малахитового Зеленого.
7. Поместите предметное стекло поверх стакана с кипящей водой на горячую плиту и отпарьте горку на пару в течение 5 минут, поддерживая влажность бумаги для линз, добавляя больше красителя по капле за раз по мере необходимости.
  Примечание: Избегайте перегрева и высыхания раствора красителя.
8. Снимите предметное стекло со стакана, снимите и выбросьте бумагу для линз, дайте предметному стеклу остыть 2 минуты.
9. Держа предметное стекло под углом, тщательно промойте, распыляя слабую непрямую струю воды на предметное стекло, позволяя ему стечь по мазку.
10. Удерживая горку на уровне, залить мазок сафранином, дать постоять 1 минуту.
11. Промойте излишки сафранина, как описано в пункте 3.2.9 выше.
12. Дайте высохнуть на воздухе.
13. Изучите предметное стекло на микроскопе под масляной иммерсией с объективом 100X.
Результаты и анализ данных
1. Споры окрасятся в зеленый цвет.
2. Вегетативные клетки окрашиваются в красный цвет.
3. Некоторые вегетативные клетки будут содержать споры; Клетки окрашиваются в красный цвет, в то время как эндоспоры окрашиваются в зеленый.

Источник: Рианнон М. ЛеВек¹, Наталья Мартин¹, Эндрю Дж. Ван Альст¹, и Виктор Дж. ДиРита¹
¹ Факультет микробиологии и молекулярной генетики, Университе…