Микроскопия и окрашивание: окрашивание по Граму, капсулам и эндоспорам

Бактерии — это микроскопические живые организмы, которые имеют множество отличительных характеристик, таких как форма, расположение клеток, производят ли они капсулы или нет, а также образуют ли они споры. Все эти особенности могут быть визуализированы с помощью окрашивания и помогают в идентификации и классификации различных видов бактерий.

Чтобы изучить первые две характеристики формы и расположения клеток, мы можем использовать простую технику, называемую окрашиванием по Граму. Здесь кристаллический фиолетовый цвет наносится на бактерии, которые были тепло закреплены на предметном стекле. Далее на предметное стекло добавляют раствор йода Грама, в результате чего образуется нерастворимый комплекс между кристаллической фиалкой и раствором йода Грама. Затем наносится обесцвечиватель, и любые бактерии с толстым слоем пептидогликана окрашиваются в фиолетовый цвет, так как этот слой не так легко проникает через обесцвечиватель. Эти бактерии относятся к грамположительным.

Грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой пептидогликана и удаляют пятна от обесцвечивателя, теряя фиолетовый цвет. Тем не менее, они окрашиваются в красновато-розовый цвет, когда добавляется противопятно сафранином, которое связывается со слоем липополисахарида на их внешней стороне. После окрашивания клетки можно наблюдать на предмет морфологии, размера и расположения, например, в цепочках или кластерах, что еще больше помогает в классификации и идентификации.

Еще одним полезным приемом в арсенале микробиолога является окрашивание капсул, используемое для визуализации внешних капсул, окружающих некоторые типы бактериальных клеток. Из-за неионогенного состава капсулы и склонности отталкивать пятна, простые методы окрашивания не сработают. Вместо этого используется техника негативного окрашивания, при которой сначала окрашивается фон кислотным красителем, таким как красный Конго, а затем бактериальные клетки окрашиваются кристаллическим фиолетовым цветом. Это оставляет любую капсулу в виде четкого ореола вокруг клеток.

Последний основной метод окрашивания, рассмотренный здесь, может помочь определить, образуют ли изучаемые бактерии споры. В неблагоприятных условиях некоторые бактерии продуцируют эндоспоры, спящие, жесткие, нерепродуктивные структуры, основная функция которых заключается в обеспечении выживания бактерий в периоды стресса окружающей среды, таких как экстремальные температуры или обезвоживание. Тем не менее, не все виды бактерий производят эндоспоры, и их трудно окрашивать стандартными методами, потому что они непроницаемы для многих красителей. В методе Шеффера-Фултона используется малахитовый зеленый морилка, который наносится на бактерии, закрепленные на предметном стекле. Затем предметное стекло промывают водой, а затем окрашивают сафранином. Вегетативные клетки будут казаться розовато-красными, в то время как любые присутствующие эндоспоры будут казаться зелеными. В этом видео вы узнаете, как выполнять эти распространенные методы бактериального окрашивания, а затем изучите образцы окрашивания с помощью световой микроскопии.

Чтобы начать процедуру, завяжите назад длинные волосы и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки.

Затем очистите свежее предметное стекло микроскопа лабораторной салфеткой. Затем нанесите пипеткой 10 микролитров 1X фосфатно-солевого буфера на первое предметное стекло. Затем с помощью стерильного наконечника для пипетки выберите одну бактериальную колонию из агаровой пластины LB. Намажьте колонию бактерий в жидкость, чтобы получился тонкий, ровный слой. Установите горку на столешницу и дайте ей полностью высохнуть на воздухе.

После высыхания зажгите горелку Бунзена, чтобы нагреть бактерии. С помощью щипцов пропустите предметное стекло через пламя горелки несколько раз стороной вверх, стараясь не удерживать предметное стекло в пламени слишком долго, что может деформировать клетки.

Теперь, работая над раковиной, удерживайте предметное стекло на одном уровне и нанесите несколько капель кристаллической фиалки Грэма, чтобы полностью покрыть бактериальный мазок, а затем положите предметное стекло на скамейку, чтобы постоять 45 секунд. Затем держите предметное стекло под углом и осторожно распылите струю воды на верхнюю часть предметного стекла, стараясь не разбрызгать бактериальный мазок напрямую. Теперь, снова удерживая затвор на одном уровне, нанесите раствор йода Грама, чтобы полностью покрыть окрашенные бактерии, а затем дайте ему постоять еще 45 секунд. Далее тщательно смойте йод с предметного стекла, как показано ранее. Удерживая предметное стекло под углом, добавьте несколько капель обесцвечивателя Грэма на предметное стекло, позволяя ему стекать по окрашенным бактериям, пока стекание не станет прозрачным, в течение примерно 5 секунд. Немедленно промойте водой, как показано ранее. Это ограничит чрезмерное обесцвечивание мазка. Затем, снова удерживая уровень слайда, нанесите противокраситель сафранина Грама, чтобы полностью покрыть окрашенные бактерии. Через 45 секунд аккуратно смойте сафранин с горки водой, как показано ранее, а затем промокните насухо бумажными полотенцами.

Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла непосредственно на предметное стекло, а затем рассмотрите предметное стекло с помощью светового микроскопа со 100-кратным масляным объективом.

Чтобы начать этот протокол окрашивания, сначала наденьте правильное средство индивидуальной защиты, а затем убедитесь, что стеклянные стекла, которые будут использоваться, чистые.

Далее приготовьте растворы. Чтобы приготовить 1% раствор кристаллической фиалки, смешайте 0,25 грамма порошка кристаллической фиалки с 25 миллилитрами дистиллированной воды и смешайте до полного растворения. Затем приготовьте 1% раствор конголезского красного, смешав 0,25 грамма порошка конголезского красного с 25 миллилитрами дистиллированной воды и вортексом до полного растворения. Теперь нанесите пипеткой 10 микролитров раствора конголезского красного на предметное стекло. С помощью чистого стерильного наконечника для пипетки выберите одну бактериальную колонию из агаровой пластины LB. Затем размажьте колонию бактерий по красителю, чтобы получить тонкий, ровный слой. Полностью высушите бактериальную горку на воздухе в течение 5-7 минут. Как только предметное стекло высохнет, налейте на мазок достаточное количество 1% кристаллического фиолетового, чтобы покрыть мазок, и оставьте на 1 минуту. Теперь держите предметное стекло под углом и осторожно распылите струю воды на верхнюю часть горки, стараясь не разбрызгивать бактерии напрямую. Продолжайте удерживать предметное стекло под углом 45 градусов до полного высыхания на воздухе. Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла непосредственно на предметное стекло, а затем рассмотрите предметное стекло с помощью светового микроскопа с 100-кратным масляным объективом.

Чтобы выполнить окрашивание эндоспор, сначала приготовьте 0,5% раствор малахитового зеленого цвета, смешав 0. 125 грамм порошка малахитового зеленого цвета с 25 миллилитрами дистиллированной воды, а затем перемешать раствор до полного растворения. Далее нанесите пипеткой 10 микролитров 1X PBS на центр предметного стекла. Затем с помощью стерильного наконечника для пипетки выберите одну бактериальную колонию из агаровой пластины LB. Размажьте бактерии в жидкости, чтобы получился тонкий, ровный слой. Теперь установите предметное стекло на столешницу и дайте ему полностью высохнуть на воздухе. После высыхания зажгите горелку Бунзена, чтобы нагреть бактерии. Пропустите предметное стекло через пламя синей горелки несколько раз стороной бактерий вверх. Затем, когда предметное стекло остынет, положите лист предварительно вырезанной бумаги для линз поверх термофиксированного мазка. Далее включите конфорку на самый высокий уровень, и доведите стакан с водой до кипения.

Пропитайте бумагу для линз раствором малахитового зеленого цвета и с помощью щипцов поместите предметное стекло поверх стакана с кипящей водой на 5 минут. Поддерживайте влажность бумаги для линз, добавляя еще красителя, по одной капле за раз, по мере необходимости. Далее, опять же с помощью щипцов, поднимите предметное стекло из стакана и снимите и выбросьте бумагу для линз. Дайте предметному стеклу остыть в течение 2 минут. Работая над раковиной, держите горку под углом и осторожно выплесните струю воды на верхнюю часть горки. Теперь удерживайте предметное стекло на уровне и нанесите сафранин, чтобы полностью покрыть предметное стекло. Затем дайте ему постоять 1 минуту. Затем держите предметное стекло под углом и смойте, как показано ранее. Дайте слайду высохнуть на воздухе на столе. Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла прямо на предметное стекло, а затем рассмотрите предметное стекло с помощью светового микроскопа с масляным объективом 100X.

В протоколе окрашивания по Граму могут получиться два пятна разного цвета. Темно-фиолетовое окрашивание указывает на то, что бактерии являются грамположительными и что они сохранили кристально-фиолетовое окрашивание. Напротив, красновато-розовое окрашивание является характерным для грамотрицательных бактерий, которые вместо этого будут окрашены противоотверженным веществом Safranin. Кроме того, после окрашивания по Граму можно визуализировать различные формы и расположение бактерий. Например, можно отличить Cocci, или круглые бактерии, от палочковидных Bacillus, или идентифицировать бактерии, которые образуют нити, по сравнению с теми, которые обычно собираются в комки или встречаются поодиночке.

На изображении, окрашенном под микроскопом капсулы, бактериальные клетки, как правило, окрашены в фиолетовый цвет, а фон предметного стекла должен быть окрашен в темный цвет. На этом темном фоне капсулы бактерий, если они присутствуют, будут выглядеть как четкий ореол вокруг клеток.

Наконец, при окрашивании эндоспор вегетативные клетки окрашиваются в красный цвет противоморочником Safranin. Если в образце присутствуют эндоспоры, они сохраняют малахитовое зеленое пятно и имеют голубовато-зеленый цвет.