$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Как правило, в случае с новыми мРНК известна только часть их полной последовательности. Недостающие нуклеотидные последовательности на концах мРНК могут быть определены с помощью метода на основе ПЦР, называемого быстрой амплификацией концов кДНК, или RACE.
У эукариот зрелые мРНК имеют отличительные структурные особенности на обоих концах. На пятипростом конце большинство из них имеют метилированный остаток гуанозина, соединенный с мРНК через связь между пятью простыми и пятью простыми трифосфатами. Это также известно как капитализация с пятью простыми числами. На трех простых концах большинство эукариот имеют хвост от 20 до 250 аденилатных остатков, называемый поли(А)-хвостом.
Теперь, если нуклеотидная последовательность даже небольшого сегмента известна где-либо внутри мРНК, последовательность вплоть до ее трехпрайм-конца может быть амплифицирована с помощью ген-специфичного праймера и неспецифического олиго(dT)-праймера, который отжигает поли(А)-хвост на трехпростом конце. Это подмножество метода RACE называется RACE с тремя простыми числами, и оно позволяет обнаруживать варианты транскриптов и различные нетранслируемые области с тремя простыми числами, или UTR.
Последовательность на пяти простых концах может быть усилена аналогичным образом. Для этого сначала прикрепляется поли(А)-хвост на пятипростом конце. Затем, используя неспецифический олиго(dT) праймер, который отжигает к присоединенному хвосту, и ген-специфичный праймер, последовательность до пятипростого конца может быть амплифицирована. Это подмножество RACE известно как RACE с пятью простыми числами и используется для поиска дифференциальных вариантов сплайсинга с пятью простыми числами и альтернативных UTR с пятью простыми.
Для проведения трехпрайм-RACE для идентификации различных транскриптов, кодируемых данным геном, РНК сначала выделяют из организма или ткани, представляющей интерес. Затем кДНК синтезируется из выделенных мРНК с помощью реакции обратной транскрипции, в которой используется олиго(dT) праймер и фермент обратной транскриптазы, который генерирует комплементарную ДНК из матрицы РНК. Затем, из сгенерированного пула кДНК, неизвестный трехпрайм-конец кДНК-мишени расширяют с помощью ПЦР с использованием неспецифического олиго(dT) праймера и ген-специфичного праймера, и амплифицируют во время ПЦР-реакции.
Однако из-за родовой природы неспецифического праймера и случайного миспрайминга со стороны ген-специфичного праймера они могут отжигать нецелевые кДНК, вызывая их также амплификацию. Чтобы преодолеть эту проблему, проводится второй раунд ПЦР с использованием вложенных праймеров, которые связываются после первого набора праймеров. Этот второй набор праймеров дополнительно усиливает интересующую кДНК, но не неспецифический продукт, увеличивая специфичность и выход реакции.
Наконец, продукты ПЦР разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, который разделяет различные транскрипты гена-мишени в зависимости от их размеров, образуя отдельные полосы. Затем интересующая полоса может быть вырезана, очищена и, наконец, секвенирована для получения полной последовательности транскрипта.
В этом видео мы продемонстрируем метод RACE с тремя простыми числами для идентификации и выделения различных транскриптов, кодируемых геном dSmad2 дрозофилы.
Прежде чем начать синтез и амплификацию кДНК, используйте программное обеспечение для разработки праймеров для создания специфичного праймера с пятью простыми числами для интересующего гена, в данном примере dSmad2. Чтобы гарантировать высокую специфичность праймера, он должен содержать около 24 нуклеотидов и иметь Tm в диапазоне от 55 до 65 градусов Цельсия. Затем спроектируйте второй вложенный праймер, расположенный с тремя простыми числами от первого праймера, который также специфичен для целевой последовательности.
Для начала извлеките РНК из 10 целых взрослых мух с помощью коммерчески доступного набора для экстракции РНК. После извлечения РНК повторно суспендируйте гранулу в 20 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Для реакции объемом 50 микролитров добавьте по 5 микролитров реакционного буфера в каждую пробирку с образцом и увеличьте объем реакции, добавив 24 микролитра воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте 1 микролитр ДНКазы I, чтобы предотвратить амплификацию геномной ДНК. Наконец, инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
После обработки ДНКазой инактивируйте фермент с помощью 1 микролитра 25 миллимолярной ЭДТА в каждой из пробирок. Добавьте образец в спиновую колонку для очистки РНК. Далее с помощью микрообъемного спектрофотометра измерьте концентрацию РНК. Отрегулируйте концентрацию до 100 нанограмм на микролитр, добавив воду, не содержащую нуклеаз.
Теперь приготовьте мастер-микс для реакции обратной транскрипции. В дополнение к анализируемым образцам ДНК включите один отрицательный контроль, пропустив обратную транскриптазу из соответствующей пробирки. Инкубируйте реакции в течение 90 минут при температуре 42 градуса Цельсия. Затем инактивируйте обратную транскриптазу, инкубируя пробирки при температуре 85 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем разбавьте уровни ДНК, добавив 80 микролитров TE-буфера в каждую пробирку, чтобы довести общую реакцию до 100 микролитров.
Теперь, когда кДНК синтезирована, амплифицируйте интересующий ген с помощью ПЦР. Для этого сначала готовят первый раунд амплификации ПЦР-смесью. В дополнение к матрице кДНК включите отрицательную реакцию контроля, в которой используется матрица из продукта, не подвергнутого обратной транскрибированию, а также реакцию, в которой в качестве контроля без праймера используется ген-специфичный праймер.
После того, как реакции подготовлены, проведите амплификацию ПЦР в амплификаторе, оснащенном крышкой с подогревом. Далее разбавьте продукты 1 к 20, добавив 1 микролитр продуктов ПЦР на 19 микролитров TE буфера. Используя эти разведенные средства, готовят второй раунд амплификации ПЦР-смесью. Затем используйте термоамплификатор для запуска второго ПЦР.
Чтобы выделить фрагменты ПЦР, приготовьте 1% агарозный гель, добавив 1 грамм агарозы на 100 миллилитров буфера ТАЕ. Растопите смесь в течение двух минут в микроволновой печи, а затем добавьте морилку SYBR Safe или бромид этидия. Вылейте расплавленную смесь в лоток для геля и дайте ей застыть.
Пока гель схватывается, пипетка 1 микролитр капли 6X Loading Dye нанесите на кусочек парапленки, соответствующий количеству образцов. Добавьте 5 микролитров образца в каждую каплю. Теперь загрузите образцы вместе с лестницей ДНК на 1 килооснование в гель. Запустите гель при напряжении 120 вольт в течение примерно 45 минут или пока фронт красителя не окажется на 75% пути вниз по гелю.
Когда гель закончит течь, проверьте гелевые ленты под УФ-транслюминатором. Найдите полосы и вырежьте их с помощью скальпеля. Очистите фрагменты кДНК с помощью коммерчески доступного набора спин-колонок. После очистки фрагменты кДНК могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия или сразу же использоваться для дальнейшего анализа.
До этого эксперимента два транскрипта для Drosophila dSmad2 были аннотированы в базе данных генома Drosophila, FlyBase. Основываясь на ожидаемом сплайсинге этого гена, два продукта должны быть идентифицированы по протоколу RACE с тремя простыми числами.
Результаты этого эксперимента, однако, показывают три различные транскрипции для dSmad2. Среди предсказанных продуктов один транскрипт является преобладающим, а другой экспрессируется на более низком уровне. Кроме того, был обнаружен ранее не описанный меньший по размеру продукт, видимый на 750 парах оснований.
