Магнитная система Tether по расследованию Визуальные и обонятельного опосредованного управления полетом у дрозофилы

Развитие области обоняния Joof привело к созданию все более сложных поведенческих тестов, таких как установка для обонятельного магнитного привязывания или OMT. Данная процедура предполагает приклеивание спинного отдела груди мухи к булавке mnuchin. Муху подвешивают под углом 30 градусов, закрепив булавку под соответствующим наклоном, после чего выравнивают между двумя редкоземельными магнитами.

При правильном выполнении этого действия будет обеспечена свободная амплитуда движений. Затем порт подачи запаха выравнивают таким образом, чтобы шлейф плавно перемещался от сопла подачи через голову мухи в вакуумную камеру. После этого тестируют способность мухи обнаруживать одорант в присутствии визуальных стимулов.

Здравствуйте, я Брайан ДеМарс из лаборатории доктора Марка Фрая с кафедры физиологических наук Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Сегодня мы покажем вам, как фиксировать мух для использования в магнитном приборе для обонятельного тетеринга. Мы также продемонстрируем, как выравнивать магниты и порты подачи запахов, а также устанавливать скорость массового потока для системы подачи запахов.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения управления полетом у плодовых мушек, опосредованного зрительными и обонятельными стимулами. Итак, приступим. Для начала фиксации соберите мушек через четыре-шесть дней после вылупления из яиц и подвергните их голоданию в течение четырех-шести часов.

В пробирку с кормовой средой, содержащую влажную салфетку Kimwipe для предотвращения высыхания, перенесите партию помеченных мух в маленькую пробирку, вставленную в латунный блок на охлаждающем столе Пельтье, установленном на четыре градуса Celsius. При такой температуре мухи будут анестезированы примерно в течение 30 секунд.

Положите салфетку Kim wipe на охлаждающий столик для поглощения влаги. Затем поместите анестезированных мух на столик для сортировки и выберите самых крупных самок для фиксации. С помощью тонкой кисточки переместите одну муху в специально изготовленный саркофаг, форма которого соответствует размеру одной самки дрозофилы дикого типа.

Теперь с помощью микроскопа убедитесь, что муха правильно расположена дорсальной стороной вверх. Передний конец мухи должен быть направлен к вам, а задний — от вас. Затем установите булавку Минухина с магнитным стержнем, закрепленным на микроманипуляторе.

Булавку следует расположить так, чтобы её тупой конец был направлен к спинной стороне груди мухи. Это место находится сразу за головой, между двумя крыльями. Муха должна быть правильно зафиксирована на булавке по трем осям.

Тангаж, крен и рыскание: булавка должна быть строго вертикальной при взгляде спереди, со стороны глаз; даже небольшой крен между мухой и булавкой недопустим. Угол в профиль между булавкой и продольной осью тела (тангаж) должен составлять 30 градусов с наклоном головы вверх относительно горизонта. Имейте в виду, что для оптимальной работы системы фиксации может потребоваться подрезка булавки.

Это будет зависеть от расстояния между подвесными магнитами. После выравнивания штифта Мнухина с помощью тонкой стальной проволоки нанесите маленькую каплю УФ-активируемого клея на тупой конец штифта. Теперь переместите штифт так, чтобы капля клея коснулась груди мухи чуть выше головы.

Следите за тем, чтобы не использовать слишком много клея. При правильном размере капли клей должен зафиксироваться и стечь с булавки на грудной отдел. Затем отвердите клей двумя 22-секундными импульсами УФ-излучения.

После завершения фиксации с помощью пинцета предложите каждой мухе небольшой квадратный бумажный платок Kimwipe, используя их инстинктивный рефлекс приземления. Мухи ухватятся за салфетки. После одного часа восстановления зафиксированные мухи будут готовы к экспериментам.

Для обеспечения плавного диапазона движения на 360 градусов крайне важно правильно выровнять магниты. Для этого удерживайте нижние кольцевые магниты горизонтально с помощью пластиковой втулки и поместите их непосредственно на прозрачную вакуумную камеру. Верхний стержневой магнит зафиксирован вертикально примерно на три четверти дюйма выше нижних магнитов; к нижней поверхности верхнего магнита эпоксидным клеем прикреплен V-образный двойной подшипник.

Это обеспечит стандартизацию положения мух и минимизирует вращательное трение. Имейте в виду, что использование таких магнитов может быть опасным, а неосторожное обращение с ними может привести к повреждению оборудования или легким телесным повреждениям. Затем примерно совместите верхний и нижний магниты визуально.

Расположив верхний стержневой магнит непосредственно над центром нижних кольцевых магнитов, рекомендуется закрепить верхний магнит в микроманипуляторе для точной регулировки. Теперь поместите муху в арену и отрегулируйте горизонтальное и вертикальное положение верхнего магнита до тех пор, пока муха не сможет плавно и равномерно совершать поворот на 360 градусов в начале каждого эксперимента; следует проверить плавность вращения каждой мухи, чтобы убедиться в правильной центровке магнитов и отсутствии повреждений штифтов мюнхина. При неправильной настройке установка муха может вообще не вращаться.

Возможна ограниченная амплитуда движений или вращение с нестабильной скоростью. Это может быть следствием проблем с приклеиванием, что можно проверить, вращая перед мухой полосатую решетку для вызывания омо-ответа. Если муха не вращается или вращается нестабильно, замените ее другой мухой.

Если эта муха вращается неправильно и подобные проблемы наблюдаются у каждой особи, то причина, скорее всего, заключается в разбежке магнитов, и для достижения стабильного запаха потребуется дальнейшая регулировка. Для настройки системы подачи запахов необходимо проложить тефлоновые трубки малого диаметра от газового мультиплексора к специально изготовленным флаконам с водным раствором аттрактанта. Выход из этих флаконов должен быть напрямую соединен с трубками гиподермического порта с помощью таких же тефлоновых трубок.

Затем под ареной устанавливают прозрачную акриловую вакуумную камеру для поддержки магнитов. Используйте стеклянную трубку диаметром 4 мм, закрепленную под мухой и подключенную к вакуумной камере, чтобы расположить отверстие для вакуума ближе к мухе и уменьшить диаметр этого отверстия. Теперь с помощью пинцета поместите привязанную муху в арену.

Когда муха будет зафиксирована, подайте приманивающий запах. Вы можете визуально убедиться, направляется ли муха к отверстию подачи запаха после его включения. Если муха не проявляет предпочтения к запаху, используйте метод проб и ошибок для оптимизации OMT.

Для этого сначала отрегулируйте положение порта подачи запаха до тех пор, пока муха не начнет отслеживать запах. В данном случае порты подачи запаха установлены на микromanипуляторах и расположены в четырех миллиметрах дорсально и в трех миллиметрах антериально относительно головы мухи. Если изменение положения порта не улучшает отслеживание запаха, отрегулируйте скорость массового потока до тех пор, пока муха не начнет отслеживать запах.

Мы используем настройки со скоростью потока семь миллилитров в минуту. Если регулировка массового расхода не приводит к улучшению отслеживания запаха, следует корректировать скорость потока вакуума до тех пор, пока муха не начнет отслеживать запах. Мы устанавливаем скорость потока вакуума на уровне 13 литров в минуту с помощью регулятора потока.

После установки положения порта и настройки скорости потока периодически переключайтесь между подачей водяного пара и ароматического пара с помощью переключаемого газового мультиплексора. При правильной настройке установки должны наблюдаться два явления. Во-первых, при постоянной вращающейся визуальной стимуляции зафиксированная муха, помещенная в OMT, должна плавно вращаться на 360 градусов в вертикальной или ya оси; резкие повороты, называемые kos, характерны для спонтанного поворотного поведения в отсутствие постоянных визуальных стимулов.

Если мухи не могут плавно вращаться, причиной могут быть неправильная склейка или смещение магнитов. Кроме того, убедитесь, что при подаче запаха муха направляется в сторону порта подачи запаха. Когда подача запаха прекращается, муха должна спонтанно передвигаться без предпочтения какой-либо определенной позиции в арене.

Если мухи не отслеживают активно шлейф запаха, это может означать, что необходимо отрегулировать положение порта подачи запаха, скорость воздушного потока и/или скорость вакуумного потока. Мы только что продемонстрировали, как зафиксировать муху для использования в аппарате для ольфакторного магнитного прикрепления. Мы также показали, как правильно выровнять магниты и порты подачи запаха, а также как установить скорость массового потока для системы доставки запаха.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.