Микро-диск массива при хроническом В естественных условиях Запись: Тетроде Ассамблеи

В данном протоколе мы описываем изготовление и имплантацию пучков Tetros из четырех электродов для хронической регистрации in vivo у бодрствующего грызуна. Для начала изготовления тетродов нить из микроэлектродных проволок складывается вдвое дважды, чтобы сформировать пучок из четырех параллельных проволок. Затем эти проволоки скручиваются между собой и фиксируются с помощью термопистолета.

Каждый готовый теро помещают в контейнер для хранения. По мере изготовления новых теро каждый из них вставляют в специальный канал, который входит через отверстие в линейном приводе и выходит через основание массива микроприводов. Каждый из четырех проводов теро подключается к отдельным контактам на плате выходного разъема, закрепленной в верхней части массива микроприводов.

Импеданс каждого канала теро снижают с помощью процесса золотого электроосаждения. После установки и электроосаждения всех теро к соответствующим контактам на плате разъемов подключают два заземляющих провода, а к раме массива микроприводов для защиты прикрепляют защитный конус после его заземления. Теперь массивы микроприводов Tero функционируют и готовы к имплантации. Здравствуйте, я Дейв Ньян из лаборатории Ната Уилсона в Институте обучения и памяти Пикоут.

Сегодня в MIT мы продемонстрируем вам процедуру изготовления тетродов, их установки и завершающие этапы реконструкции микрозондового привода. Эту процедуру мы используем в нашей лаборатории для изучения координированной нейронной активности больших популяций нейронов у бодрствующего животного в условиях выполнения поведенческих задач. Итак, приступим.

Для сборки теро для нашего стандартного массива микроприводов мы берем кусок изолированного микропровода диаметром 12 micron длиной 50 centimeter. Сложите провод пополам и проведите пальцами вдоль пары, чтобы они плотно прилегали друг к другу. Убедитесь, что пара проводов имеет хороший контакт по всей своей длине.

Сложите пару еще раз, совместив два конца. Убедитесь, что петля, образовавшаяся на одном конце, не перекручена. Обрежьте четыре провода на конце без петли так, чтобы четыре кончика были выровнены.

Для следующего этапа вам понадобятся модифицированный зажим «крокодил», моторизированное поворотное устройство и горизонтальная перекладина над поворотным устройством. Зажим «крокодил» модифицируют путем приклеивания пластиновой планки к основанию зажима. Когда концы проводов окажутся открытыми, зафиксируйте четыре провода вместе с помощью модифицированного зажима «крокодил».

Навесьте проволочную петлю на горизонтальную перекладину. Поместите зажим-«крокодил» в моторизованную стадию. В течение примерно трех минут выполните 80 поворотов пучка проволоки по часовой стрелке, а затем 40 поворотов против часовой стрелки.

Эти параметры можно изменять в зависимости от ваших потребностей. После завершения скручивания сплавьте провода вместе, прогревая их строительным феном с трех разных ракурсов, используя средний или низкий поток воздуха для каждого ракурса; начинайте прогрев на 1–2 см ниже места разделения пучка проводов. Затем перемещайте фен вниз и вверх на расстоянии 2 см от проводов в течение примерно пяти секунд.

Соблюдайте осторожность, так как высокие температуры приведут к полному расплавлению изоляции и возникновению коротких замыканий. После того как провода спаялись, извлеките теро из устройства для скручивания, осторожно приподняв зажим «крокодил», чтобы снять натяжение с теро, и разрежьте теро рядом с зажимом. С другого конца разрежьте петлю так, чтобы получилось четыре немаркированные жилы провода равной длины. Затем разделите отдельные жилы сверху, осторожно разгибая провода мягким пинцетом.

Теперь теро готов к загрузке в массив микроприводов. Изготовьте еще от 21 до 25 Tet-дорожек и храните их в безпылевом боксе до начала процесса загрузки теро. Если вы еще не собрали массив микроприводов, вам потребуется полный комплект.

Обратитесь к видеоролику «Изготовление массива микроэлектродных приводов для хронической регистрации in vivo» в нашем плане проектирования. Теро будет прикреплен одним концом к соединительному оборудованию и проведен через полимидную трубку-носитель в микроприводе так, чтобы кончики электродов выходили за пределы основания массива микроприводов. Теперь мы продемонстрируем процесс загрузки одного теро.

Перед началом работы сконструируйте держатель для привода, который одним концом крепится к плате разъемов, а другим может быть зафиксирован в контейнере со льдом. В данном примере в качестве держателя используется разъем milax, приклеенный к одному концу рукоятки скальпеля X exacto. Удерживая тетроде (tero) мягкими пинцетами и используя стереомикроскоп, вставьте кончик тетрода в полиамидную трубку-носитель одного из микроприводов. Вводите тетрод в трубку до тех пор, пока отдельные провода электродов не окажутся близко к плате разъемов в верхней части массива приводов. Будьте осторожны, чтобы не перегибать провода, так как это приведет к тому, что тетрод войдет в мозг под углом, а не перпендикулярно, и нарушит его целостность.

Теперь аккуратно вставьте другой конец четырех проводов в соответствующие отверстия на плате интерфейса электродов, используя пинцет с мягкими наконечниками. Снова следите за тем, чтобы провода не перегибались и не скручивались. Когда все четыре провода будут на месте, вставьте золотые контакты в отверстия с помощью плоскогубцев с укороченными губками.

При вталкивании контактов в отверстие изоляция провода будет удалена, что обеспечит электрическое соединение для последующего использования. Ведите учет соответствия между микроприводами и положением контактов на плате интерфейса электродов. Продолжайте установку до достижения общего количества в 18 тетродов.

Три оставшихся микропривода в массиве будут использоваться для размещения вспомогательных электродов. Каждый вспомогательный электрод изготовлен из tero, в котором используется только один из четырех непаяных yns. Чтобы установить вспомогательные электроды, следуйте процедуре загрузки, но присоедините только один из четырех электродов к соответствующему контакту вспомогательного электрода на плате разъема.

Если вы планируете многоканальную запись, может быть полезно заранее продумать схему соединений от тетродов к плате коммутатора. Например, сгруппируйте на плате интерфейса электродов тетроды, предназначенные для одной анатомической области. Это позволит свести к минимуму вероятность регулировки не того тетрода во время экспериментов.

После завершения загрузки tero изготовьте два заземляющих провода: один для животного, другой — для защитного конуса. Отрежьте изолированный стальной провод длиной six inch и снимите три миллиметра изоляции с каждого конца провода с помощью металлического пинцета. Затем отрежьте изолированный стальной провод длиной four inch.

Снимите три миллиметра изоляции с одного конца и один сантиметр с другого конца. Пропустите заземляющий провод длиной шесть дюймов через отверстие на боковой стороне массива микродрайверов в направлении интерфейсной платы. Подсоедините оголенный провод к интерфейсной плате электродов с помощью золотого штифта в соответствующем отверстии заземления.

Этот провод будет подключен к черепу животного. Проложите заземляющий провод длиной four inch параллельно ранее установленному заземляющему проводу. Подсоедините зачищенный конец длиной three millimeter к плате интерфейса электродов, используя позолоченный штырек в другом предназначенном для этого отверстии заземления.

Этот провод позже будет подключен к защитному конусу, который будет выполнять роль небольшой клетки Фарадея для снижения уровня помех. Теперь, когда подключение проводов завершено, можно приступить к доработке теродов. Цель этого процесса — обрезать все тероды так, чтобы они были немного длиннее, чем глубина целевой структуры мозга, как показано в нашем примере.

Микроприводы рассчитаны на максимальный ход от пяти до шести миллиметров, чего достаточно для достижения многих областей неокортекса и дорсального гиппокампа взрослой крысы. Сначала опустите все микроприводы так, чтобы тетроды были максимально открыты одновременно. Обрежьте все тетроды до длины, которая примерно на пять миллиметров превышает желаемую конечную длину, используя пару острых тонких ножниц для финального среза.

Подготовьте пару зубчатых ножниц в кювете со льдом; закрепите одну рукоятку под небольшим углом вниз, зубцами вверх, оставив вторую рукоятку свободно свисающей. Теперь полностью втяните все электроды в их направляющие канюли, повернув микроприводы вверх. С помощью стереомикроскопа полностью выдвиньте один электрод из канюли.

С помощью линейки расположите зубчатые ножницы на нужном расстоянии от направляющей канюли. Медленно и осторожно перережьте tero одним плавным движением. После того как tero будет перерезано, поднимите микропривод на три-четыре миллиметра.

Повторите этот процесс для каждого tero, пока все они не будут обрезаны. Теперь можно приступать к золочению. Золочение.

Покрытие электродов имеет решающее значение для обеспечения стабильной регистрации сигналов в течение длительного времени. Оно предотвращает коррозию и улучшает биосовместимость. Настройте измеритель импеданса в режиме внешнего управления в генераторе тока и в режиме проверки постоянного тока (DC) с аудиовыходом.

Прикоснитесь двумя щупами генератора тока к шести возможным парам каналов внутри каждого теро и используйте аудиосигнал, чтобы определить наличие короткого замыкания между парами. Короткое замыкание между парами каналов звучит так. Если обнаружено короткое замыкание, повторно обрежьте теро зубчатыми ножницами и проведите тест снова.

Если проблема сохранится, удалите Tet road и замените его. Сместите все микроприводы вниз, максимально выдвинув все Tet road. Измените конфигурацию оборудования для проверки импеданса электродов.

Теперь погрузите кончики всех теро-электродов в ванночку со стандартным раствором для золочения. Ванночка с золотом электрически соединена с отрицательным выводом импедансметра. Проверьте импеданс электрода, прикоснувшись положительным выводом импедансметра к соответствующему контакту на плате разъемов.

Измерьте и запишите импеданс каждого провода в массиве микроприводов. Нормальные значения на генераторе тока составляют от одного до трех МОм. Установите силу тока в диапазоне от 1 до 3 µA.

Затем надежно закрепите положительный вывод импедансметра к контакту на плате разъема. На импедансметре.

Быстро переключайте устройство из нормального режима в обходной и обратно, находясь в обходном режиме. Ток будет проходить через дорожку Tet и раствор золота, и на кончике электрода будет осаждено золото. После каждого цикла напыления импеданс должен быть ниже, чем до него.

Повторите текущий импульс. Если импеданс не упал ниже одного МОм. Консервативный диапазон допустимых значений импеданса составляет от 250 кОм до 350 кОм.

Если импеданс падает ниже 200 кОм, это может указывать на короткое замыкание. Если после повторных импульсов импеданс не снижается достаточно, кончик электрода может быть засорен. Повторно обрежьте кончик, проверьте на наличие короткого замыкания и повторите процесс золочения.

Если повторная резка не помогла, замените tero и начните заново. После установки всех teros погрузите их в этанол и дайте им просохнуть в течение трех-пяти минут. Проверьте tero на наличие коротких замыканий с помощью генератора тока, когда кончики tero будут открыты для воздуха.

Если между двумя или более электродами tero существует постоянное соединение, заново обрежьте tero и повторно проведите напыление золота. После завершения золочения всех tero переместите их в привод. В качестве заключительного этапа в верхней части каждого микропривода нанесите каплю цианоакрилатного клея средней вязкости на интерфейс между каждым tero и его полимерной трубкой.

Это закрепит теро на его микроприводе. Защитный конус предназначен для защиты микроприводов и открытого провода теро от воздействия внешней среды. Он также служит опорой при манипуляциях во время эксперимента и снижает уровень электрического шума.

Мы используем пластиковый конус, напечатанный на 3D-принтере. Однако конус можно изготовить из других материалов, например, из согнутого куска алюминиевой банки. Также можно взять пластиковый конус и закрепить алюминиевую фольгированную ленту на его внутренней или внешней поверхности.

Сначала вставьте и частично закрутите три винта размера 1 72 длиной 3/16 дюйма в боковые стороны конуса, при этом массив привода должен быть подвешен. Наденьте конус на привод. Убедитесь, что оба заземляющих провода выходят из нижней части массива привода.

Обмотайте открытую часть четырехдюймового заземляющего провода вокруг одного из винтов 1 72 несколько раз и затяните винт. Плотно закрепите конус на основании привода, затянув два оставшихся винта конуса. Изготовление массива микроприводов завершено. Ваш массив микроприводов загружен 18 теро в трех референсах.

Для обеспечения долговечности устройство заключено в защитный конус и колпачок. Готовый привод обычно весит в среднем от 20 до 25 грамм.

Готовый массив электродов имплантируют с помощью стандартной хирургической процедуры. Как видно, привод подключен к чипу предусилителя и пучку проводов, которые передают сигнал на оборудование и программное обеспечение для сбора данных. Мы только что продемонстрировали вам способ изготовления электродов и завершили процедуру конструирования микро-массива электродов.

В данном видео мы продемонстрировали способ изготовления теросов, а также их заполнение и кондиционирование для регистрации данных in vivo. Кроме того, мы показали, как закрепить конус на матрице микроприводов для обеспечения ее долговечности. Процесс сборки матрицы микроприводов включает множество этапов, поэтому будьте терпеливы, осторожно обращайтесь с электродами и убедитесь в правильном выполнении всех промежуточных шагов.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.