Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных

Данная процедура начинается с удаления любых примесей из раствора вируса гриппа путем центрифугирования. Затем вирусная мембрана разрушается с помощью детергента, и высвобожденные вирусные РНП разделяются на градиенте глицерина.

Фракции центрифугирования из градиента собирают, и каждую фракцию анализируют. Гели SDS-PAGE окрашивают кумасси синим для определения пиковых фракций, содержащих V NPs. Затем фракции, содержащие V NPs, концентрируют центрифугированием, и очищенные VRP наносят на медную сетку для ТЕМ, которую затем подвергают негативному контрастированию для визуализации VRP с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Здравствуйте, я WinCo Wu из лаборатории доктора Nellie Pane на кафедре зоологии Университета Британской Колумбии.

Меня зовут Линдси Уивер, я работала в лаборатории Пейна. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру очистки вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов вируса гриппа. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения ядерного импорта вируса гриппа типа A в культивируемые клетки тканей.

Итак, приступим. Для начала эксперимента добавьте 750 µL буфера MNT в одну поликарбонатную центрифужную пробирку Beckman размером 11 мм на 34 мм. Затем добавьте в пробирку 500 µL раствора вируса гриппа А с концентрацией 2 mg/mL; несколько раз перемешайте вирус с буфером MNT, прокачивая жидкость через кончик пипетки.

После перемешивания поместите пробирку в ротор TLA one 20.2 и центрифугируйте в центрифуге Beckman Optima max E в течение 10 минут при 109 000 ×g и температуре 4 °C. По окончании центрифугирования удалите супернатант, затем ресуспендируйте осадок в 500 µL буфера для разрушения, подвергнув его интенсивному перемешиванию на вортексе. После этого инкубируйте суспендированный осадок при 31 °C в течение 20 минут в термомиксе Eppendorf.

После завершения встряхивания приступайте к седиментационному центрифугированию в глицериновом градиенте. Чтобы подготовить глицериновый градиент, поместите в центрифужную пробирку Beckman UltraClear размером 13 мм на 51 мм следующие объемы глицерина: 1 мл 70% (об./об.) глицерина, 0,75 мл 50% глицерина, 0,375 мл 40% глицерина и 1,8 мл 33% глицерина. Данные растворы глицерина готовят путем смешивания чистого глицерина с буфером NM.

Также подготовьте уравновешивающую пробирку, содержащую глицерин и буфер. Затем снова перемешайте образец разрушенного вируса на вортексе и нанесите его на глицериновый градиент. Поместите пробирку в ротор с качающимися стаканами Beckman MLS 50 и центрифугируйте градиент в течение трех часов 45 минут при 217 000 ×g и температуре четыре °C.

После завершения центрифугирования вручную соберите аликвоты градиента по 250 microliter, начиная с верхней части пробирки. Храните фракции на льду или при температуре четыре градуса Celsius. После сбора фракций можно приступать к их анализу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS.

Для начала анализа методом ЭЗС-ПАГЕ перенесите по 20 µL из каждой фракции в отдельные пробирки. Затем добавьте 5 µL 5-кратного буфера для образцов ЭЗС-ПАГЕ и нагревайте образцы при 95 °C в течение пяти минут. После нагревания кратковременно центрифугируйте образцы и нанесите их на 10%-ный полиакриламидный гель, добавив маркеры молекулярной массы в одну из лунок. Затем проведите электрофорез образцов в геле до тех пор, пока бромфеноловый синий краситель не достигнет нижней части геля.

Извлеките гель из аппарата для электрофореза в ПААГ-SDS и окрасьте его кумасси синим. На основании результатов окрашивания определите фракции, содержащие преимущественно нуклеопротеин гриппа.

Белок NP вируса гриппа А имеет размер примерно 56 килოდაльтон и является основным белком в составе вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов. Таким образом, полоса NP обычно является наиболее интенсивной полосой во фракциях, содержащих VRNP. В следующей части мы сконцентрируем эти фракции VRNP.

Объедините глицериновые фракции, содержащие преимущественно NP, и распределите их по двум поликарбонатным центрифужным пробиркам Beckman размером 11 мм на 34 мм, заполнив каждую пробирку этилпирокарбонатом или сверхчистой водой, обработанной DEPC. Затем несколько раз перемешайте содержимое путем пипетирования. Поместите пробирки в ротор Beckman TLA 120.2 и центрифугируйте в течение четырех с половиной часов при 157 000 ×g и температуре 4 °C.

По завершении центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок. В аликвотах по 50 µL воды, обработанной DEPC, очищенные V NPS разделите: одну аликвоту оставьте для текущего использования, а остальные храните при -80 °C. Теперь можно приступить к негативному окрашиванию VRPs.

Разбавьте один µL очищенного VRNP в девяти µL свежеприготовленного и дважды фильтрованного фосфатно-солевого буфера (PBS). Обработайте медную подложку для ТЕМ в приборе для свечения (glow discharge) в течение 30 секунд. Данная подложка была предварительно покрыта пленкой из Parlow Dion и углерода. Удерживая обработанную подложку пинцетом, нанесите на нее каплю разбавленного VRNP объемом пять µL.

В ожидании дайте капле впитаться в сетку в течение восьми минут. Поместите небольшую полоску парафина в кювету, затем нанесите на парафин две капли PBS-буфера по 10 µL каждая, а также каплю свежеприготовленного окрашивающего раствора объемом 80 µL, состоящего из 1% мелиата аммония. Теперь промойте сетку с образцом, осторожно погружая ее в две капли PBS в течение одной минуты в общей сложности.

Затем с помощью кусочка фильтровальной бумаги удалите часть раствора образца с сетки с объектом, не допуская высыхания сетки. Сразу после удаления последней капли буфера с сетки полностью погрузите ее в каплю красителя. Подождите одну минуту.

Через одну минуту с помощью нового кусочка фильтровальной бумаги полностью удалите раствор красителя с сеточки с образцом. Оставьте сеточку с образцом высыхать на воздухе в течение нескольких минут перед наблюдением. Ниже представлены репрезентативные снимки V nps, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа при методе негативного контрастирования.

Как здесь видно, V NPS представляют собой стержневидные частицы переменной длины, которая составляет примерно от 30 nanometers до 120 nanometers. Олигомерная NP организована в виде цепи молекул NP, которая далее сворачивается в структуру с двойным спиральным повтором. Таким образом, на обоих концах этих стержневидных частиц иногда можно наблюдать петли.

Мы только что продемонстрировали вам способ очистки и визуализации вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов гриппа. При выполнении данной процедуры важно не использовать PBS при разведении vRNPs, если для негативного окрашивания применяется урацилацетат.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.