Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы

Производить стабильные электрофизиологические записи из нервно-мышечных соединений личинок Joof. Сначала рассеките вскрытую личинку, чтобы обнажить стенки тела, мышцы и нервную систему перед записью. Аксоны у основания ЦНС разрезаются сзади от вентрального ганглия.

Затем записывающий электрод помещается на интересующую мышцу, а стимулирующий электрод размещается рядом с иннервирующими двигательными нейронами. Оторванные аксоны двигательных нейронов всасываются в стимулирующую пипетку. Затем можно регистрировать потенциалы возбуждающего перехода.

Здравствуйте, я Венди MLA из лаборатории Маккейба на факультете физиологии и клеточной биофизики Колумбийского университета. Сегодня мы покажем вам процедуру измерения передачи тиков в нервно-мышечном соединении лавы GE. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения синаптической физиологии и нейротрансмиссии.

Итак, приступим. Для начала эксперимента препарируйте блуждающих личинок третьей и звезды, чтобы обнажить стенку тела. Этот протокол модифицирован для электрофизиологических экспериментов с использованием коротких диссекционных штифтов.

Они имеют длину от двух до четырех миллиметров и с меньшей вероятностью попадут в объектив микроскопа в электродах во время эксперимента. Обнажив стенку тела, с помощью щипцов удерживайте ЦНС и слегка приподнимите ее. Затем перережьте двигательные аксоны периферических нервов и удалите мозг.

После удаления промывания мозга рассекреченный препарат дважды препарируют буфером HL 3.1 с одним миллимоляром кальция. Теперь, когда вскрытие завершено, можно сделать внутриклеточные записи из мышечных клеток личинок. Поместите диссекционную пластину на электрофизиологический микроскоп и погрузите препарат в буфер HL 3.1 плюс кальций.

Затем закрепите электрод ванны так, чтобы он соприкасался с раствором. Аспираторный электрод используется для стимуляции периферических нервов, иннервирующих мышцу. Сначала расположите всасывающий электрод в чашке, чтобы избежать вибраций при размещении внутриклеточного электрода на мышце.

Как только электрод окажется в чашке, расположите его рядом с моторным нейроном, который иннервирует шестую мышцу. В третьем брюшном сегменте применяйте мягкое отсасывание до тех пор, пока перерезанный нерв не окажется внутри стеклянной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не растянуть нервы при применении отсасывания.

Слегка поднимите пипетку, чтобы она не касалась мышцы. А затем расположите его так, чтобы он не тянул за собой перерезанные нервные волокна. Когда всасывающий электрод будет на месте, расположите записывающий электрод для внутриклеточной записи.

Используйте острый микроэлектрод, наполненный тремя молярами хлорида калия. Расположите записывающий электрод над центром шестой мышцы. Отрегулируйте входное смещение так, чтобы оно показывало ноль для раствора для ванны.

Медленно опустите электрод и приближайтесь к мышце под большим оптическим увеличением, пока она не коснется поверхности мышцы. Чтобы подтвердить, что мышца была пробита, понаблюдайте за осциллографом. Потенциал мембраны покоя должен быть не менее 60 милливольт.

Теперь должен быть виден спорадический потенциал миниатюрной пластины. Как только записывающий электрод будет на месте, дайте ячейкам стабилизироваться в течение одной минуты. Перед началом записи используйте аксон HS два, головной столик в оси зажима два усилителя B для обнаружения изменений мембранного потенциала.

Зажим моста два В является интерфейсом к компьютеру, который запускает программное обеспечение зажима P через цифровые данные 1322 А, который оцифровывает сигнал. Запишите потенциал мембраны на ПК. С помощью программного обеспечения clamp X подавайте стимулы на моторный аксон для генерации возбуждающих мембранных потенциалов или ejs.

После того, как ejs будут сгенерированы, запишите миниатюрные ejs в течение трех минут без синапсов стимулов. Программное обеспечение для анализа Soft mini можно использовать для анализа трасс и определения амплитуды и частоты mini EJP. Для генерации ejs.

Используйте генератор восьми главных импульсов для стимуляции до разорванного конца программы двигательных нейронов. Генератор выдает программу импульсов квадратного напряжения 0,3 миллисекунды. Пятисекундный интервал между стимулами для восстановления синапсов.

По данным NMJ, по меньшей мере 10 вызванных потенциалов от каждой мышцы и усредненные амплитуды. На этом рисунке показан типичный след, записанный из шестой мышцы личинки сала дикого типа с вызванными реакциями EJP и спонтанными мини-EJ.PS Мы только что показали вам, как регистрировать потенциалы cy из нервно-мышечного соединения лавы дрозофилы. При выполнении этой процедуры важно помнить о завершении вскрытия в течение 3-10 минут и немедленно начать электрофизиологическую запись, пока клетки еще здоровы и реагируют.

Если рассечение занимает слишком много времени, мембранный потенциал покоя мышечных клеток будет меньше минус 60 милливольт, что слишком мало для регистрации. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.