Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы

Для получения стабильных электрофизиологических записей с нервно-мышечных соединений личинок Joof. Сначала вскройте личинку, чтобы обнажить стенку тела, мышцы и нервную систему перед началом записи. Аксоны у основания ЦНС перерезают позади вентрального ганглия.

Затем регистрирующий электрод помещают на исследуемую мышцу, а стимулирующий электрод — рядом с иннервирующими двигательными нейронами. Перерезанные аксоны двигательных нейронов засасывают в стимулирующую пипетку. После этого можно регистрировать возбуждающие синаптические потенциалы.

Здравствуйте, я Венди МЛА из лаборатории МакКейба факультета физиологии и клеточной биофизики Колумбийского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру измерения синаптической передачи в нервно-мышечных соединениях личинок GE lava. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения физиологии синапсов и нейротрансмиссии.

Итак, приступим. Для начала эксперимента проведите диссекцию блуждающих личинок третьей стадии и звездчатых личинок, чтобы обнажить стенку тела. Данный протокол модифицирован для электрофизиологических экспериментов путем использования коротких диссекционных булавок.

Их длина составляет примерно от двух до четырех миллиметров, поэтому вероятность их соприкосновения с объективом микроскопа или электродами во время эксперимента ниже. После обнажения стенки тела с помощью пинцета зафиксируйте ЦНС и слегка приподнимите ее. Затем перережьте моторные аксоны периферических нервов и удалите мозг.

После извлечения мозга дважды промойте препарированный образец буфером HL 3.1 с содержанием кальция 1 мМ. После завершения препарирования можно приступить к внутриклеточной регистрации сигналов из мышечных клеток личинки. Поместите планшет для препарирования на электрофизиологический микроскоп и погрузите образец в буфер HL 3.1 с добавлением кальция.

Затем закрепите электрод ванны так, чтобы он контактировал с раствором. Всасывающий электрод используется для стимуляции периферических нервов, инервирующих мышцу. Сначала поместите в чашку всасывающий электрод, чтобы избежать вибраций при установке внутриклеточного электрода в мышцу.

После помещения электрода в чашку расположите его рядом с моторным нейроном, который иннервирует шестую мышцу. В третьем абдоминальном сегменте осторожно примените вакуумное всасывание, пока перерезанный нерв не окажется внутри стеклянной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не растянуть нервы при применении всасывания.

Слегка приподнимите пипетку, чтобы она не касалась мышцы. Затем расположите ее так, чтобы она не растягивала разрезанные нервные волокна. После установки присасывающего электрода установите регистрирующий электрод для проведения внутриклеточных записей.

Используйте острый микроэлектрод, заполненный 3 M раствором хлорида калия. Расположите регистрирующий электрод над центром шестой мышцы. Отрегулируйте смещение входного сигнала так, чтобы при измерении раствора в ванне прибор показывал ноль.

Медленно опустите электрод и при большом оптическом увеличении подведите его к мышце, пока он не коснется ее поверхности. Чтобы подтвердить проникновение в мышцу, наблюдайте за осциллографом. Потенциал покоя мембраны должен составлять не менее -60 mV.

Теперь должен стать виден спорадический миниатюрный потенциал пластинки. После установки записывающего электрода дайте клеткам стабилизироваться в течение одной минуты. Перед началом записи используйте axon HS two, головной усилитель в усилителе axle clamp two B для регистрации изменений мембранного потенциала.

Устройство axle clamp two B подключено к компьютеру, на котором установлено программное обеспечение P clamp, через оцифровщик данных 1322 A, осуществляющий преобразование сигнала в цифровую форму. Регистрация мембранного потенциала проводится на ПК. С помощью программного обеспечения clamp X подавайте стимулы на двигательный аксон для генерации возбуждающих мембранных потенциалов или ЭПС.

После генерации EJP запишите миниатюрные EJP в течение трехминутного периода без синаптической стимуляции. Для анализа трасс и определения амплитуды и частоты миниатюрных EJP можно использовать программное обеспечение Soft mini analysis. Чтобы генерировать EJP.

Используйте восьмиканальный генератор импульсов для стимуляции проксимального конца перерезанного моторного нейрона. Настройте генератор на подачу прямоугольных импульсов напряжения длительностью 0,3 millisecond. Установите интервал в пять секунд между стимулами для обеспечения восстановления синаптической передачи.

На НМС зарегистрируйте не менее 10 вызванных потенциалов от каждой мышцы и вычислите среднее значение амплитуд. На данном рисунке показана типичная запись от шестой мышцы личинки дикого типа sal с вызванными ответами ПЭП и спонтанными мини-ПЭП. Мы только что продемонстрировали вам способ регистрации потенциалов с нервно-мышечного синапса личинки Drosophila. При выполнении данной процедуры важно помнить, что диссекцию необходимо завершить в течение 3–10 минут и немедленно приступить к электрофизиологическим записям, пока клетки остаются жизнеспособными и чувствительными.

Если препарирование займет слишком много времени, потенциал покоя мембран мышечных клеток станет ниже -60 мВ, что будет слишком низким значением для регистрации. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.