Мышей почечная Процедура трансплантации

Процедура трансплантации почки мыши начинается с забора донорского органа, при котором левая почка удаляется у мыши-донора и хранится на льду. Затем у мыши-реципиента удаляется правая почка, чтобы освободить место для донорской почки. После этого донорскую почку извлекают из льда и пересаживают мыши-реципиенту.

Мыши дают восстановиться в течение четырех дней, после чего удаляют оставшуюся нативную почку. Спустя семь дней контролируют уровень креатинина с помощью портативного клинического анализатора I STAT для оценки функции трансплантата. Здравствуйте, я Сара Хаймер из лаборатории доктора Грега Хэдли и отделения трансплантационной хирургии Университета штата Огайо.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру трансплантации почки у мыши. Операцию по трансплантации почки, которую вы увидите сегодня, проведет наш штатный эксперт, нейрохирург Jing Wing. Пожалуйста, используйте данную процедуру в нашей лаборатории для изучения иммунологических событий при отторжении трансплантата, а также стратегий по предотвращению этого процесса.

Итак, приступим. Чтобы начать забор донорского органа, выполняют щипковый тест (toe pinch), чтобы убедиться, что животное полностью находится под наркозом. Работая в стерильном поле и используя стерильные инструменты, сделайте срединный разрез на анестезированной мыши от грудины до лобка и обнажите левую почку, отодвинув кишечник латерально в правую сторону для проведения перфузии донорской почки. Наложите шелковые швы TY 4-0 вокруг аорты и нижней полой вены ниже и выше почечной артерии и вены.

Медленно проведите перфузию in situ холодным гепаринизированным раствором Рингера-лактата через инфраренальный отдел аорты. Изолируйте левую почку, перевязав и пересекши сосуды надпочечников, семенных сосудов и нескольких поясничных ветвей шелковой нитью 8-0. Затем мобилизуйте место соединения аорты и нижней полой вены с левой почечной артерией и веной; наложите четыре шелковые лигатуры 8-0 на аорту и нижнюю полую вену выше и ниже почечной артерии и вены.

Чтобы минимизировать кровопотерю, первым делом перевяжите аорту ниже почечного сосуда. Затем препарируйте левый мочеточник, освободив его от почечной ножки до мочевого пузыря. Обнажите место соединения мочеточника с пузырем, используя ретракцию купола мочевого пузыря.

Осторожно избегая правого мочеточника, иссекают небольшой эллиптический лоскут мочевого пузыря, содержащий место соединения левого мочеточника с пузырем. Этот лоскут будет использован для реконструкции мочевыводящих путей путем создания анастомоза между частями мочевого пузыря. Затем перевязывают аорту выше почечной артерии и вены.

Медленно проведите перфузию рафта in situ холодным гепаринизированным раствором Рингера-лактата через подпочечную аорту. Перережьте аорту косо примерно на два миллиметра ниже почечной артерии. В завершение удалите почку вместе с сосудистой ножкой и мочеточником, прикрепленным к лоскуту мочевого пузыря, единым блоком.

Почку следует хранить в растворе Рингера-лактата на льду до момента ее пересадки реципиенту; донорскую мышь эвтаназируют путем перелома шейных позвонков под воздействием анестезии. Как было показано ранее, перед началом трансплантации реципиента делают щипок, чтобы убедиться в полном воздействии анестезии на животное. Для начала операции делают разрез по срединной линии, накрывают кишечник влажной марлей и осторожно отодвигают его в левую сторону.

Для успешного завершения трансплантации почки необходимо выполнить анастомоз между аортальной манжетой донора и аортой реципиента. Также следует соединить почечную вену донора с нижней полой веной реципиента, а лоскут мочевого пузыря донора — с мочевым пузырем реципиента. Правый мочеточник, почечная артерия и вена.

После лигирования поясничных ветвей удалите почку. Аккуратно изолируйте и пережмите инфраренальный отдел аорты и нижнюю полую вену двумя микрососудистыми зажимами диаметром 4 мм. Проведите нейлоновую нить 10-0 через всю толщу стенки аорты и оттяните ее, чтобы одним разрезом длиной примерно в одну пятую диаметра сосуда выполнить эллиптическую аортотомию.

Затем выполните продольную венотомию, проколов нижнюю полую вену иглой 30G, и расширьте разрез соответствующим образом с помощью микрохирургических ножниц. Промойте аорту и нижнюю полую вену гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить кровь или сгустки из просвета сосудов. Извлеките донорскую почку из льда и поместите ее в правую паховую область мыши.

Наложите две фиксирующие швы в проксимальном и дистальном концах аортотомии реципиента и манжеты аорты донора. Выполните анастомоз «конец в бок» между манжетой аорты донора и передней стенкой аортотомии реципиента, используя два или три непрерывных шва нейлоном 10-0 по наружной поверхности аорты. После этого переместите трансплантат почки донора к левому боку реципиента.

Повторите предыдущую процедуру между донорской манжеткой аорты и задней стенкой аорты реципиента. Важно помнить, что анастомоз как вены, так и артерии должен быть завершен в течение 20 минут. Кроме того, во время формирования анастомоза трансплантат следует несколько раз промыть холодным физиологическим раствором.

Выполните конец-в-бок анастомоз между донорской почечной веной и задней стенкой нижней полой вены реципиента с помощью четырех-пяти непрерывных швов нейлоном 10-0 с внутренней стороны нижней полой вены. Зашейте переднюю стенку нижней полой вены и донорскую почечную вену четырьмя-пятью непрерывными швами с внешней стороны нижней полой вены. Следующим шагом является рассечение купола мочевого пузыря реципиента.

Остановите кровотечение с помощью коагуляции. После завершения фиксации сделайте небольшой разрез на куполе, наложите два удерживающих шва нитью нейлона 10-0 для анастомоза небольшого лоскута мочевого пузыря донора с куполом мочевого пузыря реципиента; ушейте каждую сторону анастомоза восемью-десятью непрерывными стежками. В завершение зашейте брюшную полость в два слоя непрерывными стежками стерильной синтетической рассасывающейся нитью викрил 4-0.

Послеоперационный уход начинается с однократного внутримышечного введения пенициллина. Реципиенту трансплантата также вводят бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг внутримышечно в нулевой и первый дни после операции для купирования боли; кроме того, обеспечивают постоянный доступ к воде, содержащей сульфатриметизол. В течение первых 24 часов после операции мышей содержат в инкубаторе с контролируемым температурным режимом.

Шовный материал кожи удаляют через две недели после операции. Удаление оставшейся нативной почки необходимо для того, чтобы иметь возможность контролировать снижение функции трансплантата почки путем измерения уровня креатинина в сыворотке крови. Эта процедура обычно проводится через четыре–семь дней после первоначальной трансплантации донорской почки и включает в себя основные этапы, используемые при извлечении почки у мыши-донора.

Для седации животного с целью забора проб крови используется изофлуранная анестезия. Количественное определение уровня креатинина в цельной крови, полученной ретроорбитально, используется в качестве показателя для оценки функции трансплантата и проводится с помощью портативного клинического анализатора i-STAT. Традиционные единицы измерения переводятся в единицы СИ путем умножения традиционных единиц на 88,4.

Концентрация креатинина выражается в микромолях на литр. Обычно животные восстанавливаются через два-три часа после операции и демонстрируют нормальное поведение мышей после удаления оставшейся собственной почки. Выживаемость животного зависит от функции почечного трансплантата, которую можно оценивать путем ежедневного контроля общего состояния здоровья животного и уровня креатинина.

Измерение уровня креатинина в цельной крови с помощью портативного клинического анализатора i-STAT для сравнения. У нормальной мыши без трансплантации уровень креатинина составляет около 20 µM. Дисфункция почечного трансплантатa диагностируется, когда у мыши наблюдаются признаки заболевания, а уровень креатинина повышен и составляет около 100 µM.

Мы только что продемонстрировали процедуру трансплантации почки у мыши. Несмотря на то, что данная процедура технически сложна, нашей лаборатории удалось добиться в ее выполнении больших успехов. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.