Живая изображений глиальных миграции клеток в диск дрозофилы глаз имагинальных

Мы вскрываем личинок, захватывая их задний и передний концы, после чего разводим пинцеты в противоположных направлениях. Излишки ткани обрезают ультратонкими ножницами. Это позволит визуализировать два полушария имагинальных дисков глаз мозга личинки.

Брюшной нервный шнур и ротовые крючки. Личиночный глазо-мозговой комплекс переносят в культуральную камеру. Мы отделяем долю мозга от зрительного стебля, чтобы визуализировать миграцию глиальных клеток в имагинальном диске глаза дикого типа.

Чтобы наблюдать за заблокированными глиальными клетками в зрительном нерве мутанта, мы оставляем долю мозга прикрепленной к зрительному нерву. Здравствуйте, я Патрик Кафферти из лаборатории Ванессы Альс на кафедре зоологии Университета Британской Колумбии. Привет, я Рин.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру визуализации мигрирующих глиальных клеток в развивающемся глазу Drosophila. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения развития глиальных клеток. Итак, приступим.

За одну неделю до начала эксперимента проводят скрещивание мух для получения личинок, экспрессирующих GFP под контролем глиально-специфического промотора. Данный эксперимент предполагает визуализацию GFP, помеченного сигналом ядерной локализации и экспрессируемого в глиальных клетках. Используя промотор с обратной полярностью, за один или более дней до проведения эксперимента подготовьте круглые покровные стекла диаметром 18 мм, выдержав их в течение 10 минут в 1% растворе поли-L-лизина, после чего высушите их на воздухе в течение ночи накануне эксперимента.

В день проведения эксперимента очистите камеру для магнитной культуры с прикрепленной цепью, замочив её компоненты в 70% этаноле на ночь. Используйте асептические методы для приготовления культуральной среды. Добавьте фетальную бычью сыворотку, раствор пенициллина и стрептомицина, а также инсулин в 10 миллилитров среды Шнайдера для насекомых.

Дайте чистой магнитной камере для культивирования, закрепленной на цепи, высохнуть на воздухе в ламинарном шкафу, после чего удалите остатки этанола, промыв её подготовленной культуральной средой. После завершения этих подготовительных действий можно приступить к диссекции комплекса глаз-мозг дрозофилы. Для начала этой процедуры выберите личинку третьей стадии в фазе блуждания со стенки флакона с мухами и поместите её в каплю охлажденной культуральной среды в чашку Петри на льду для охлаждения в течение нескольких минут.

Для облегчения диссекции рекомендуется замедлить перистальтические сокращения тела личинки. Затем поместите охлажденную личинку в каплю культурной среды на предметное стекло, покрытое агарозой, под диссекционный микроскоп; используя тонкий пинцет Dumont, крепко захватите личинку. Примерно на одной трети расстояния от заднего конца подождите, пока личинка не высунет ротовые крючья из переднего конца, и, когда ротовые крючья будут полностью вытянуты, захватите их вторым пинцетом.

Для диссекции личинок медленно разведите две пары пинцетов в противоположные стороны. Глазно-мозговой комплекс вместе со слюнными железами, жировыми тельцами и имагинальными тканями отделится от тела личинки. Не тяните ротовые крючья слишком быстро, иначе они оторвутся от глазно-мозгового комплекса.

Удалите слюнные железы, жировые тела и имагинальные диски. С помощью ультратонких ножниц отделите два полушария мозга и диски глаз, сохранив их связь с вентральным нервным стволом и ротовыми крючками. Затем поместите покровное стекло диаметром 18 мм на предметное стекло так, чтобы один край покровного стекла выступал за пределы предметного стекла. Чтобы впоследствии было легче поднять покровное стекло, капните на него каплю культуральной среды.

Захватите ротовые крючья пинцетом и перенесите комплекс глаз и мозга в культуральную среду на покровное стекло. После переноса комплекса глаз и мозга на покровное стекло с помощью тонких диссекционных ножниц отсеките ротовые крючья от этого комплекса.

Удаление ротовых крючков важно для прижизненной визуализации, так как ротовые крючки продолжают сокращаться в культуральной среде, что вызывает смещение ткани во время микроскопии. Для визуализации глиальных клеток (GL) внутри оптического стебля оставьте мозг, оптический стебель и имагинальный диск глаза неповрежденными. Чтобы визуализировать миграцию глии внутри имагинального диска глаза, осторожно перережьте оптический стебель — тонкую ткань, соединяющую мозг и диск глаза, — и отодвиньте или удалите мозг.

Наконец, с помощью пинцета поднимите покровное стекло и обведите область интересующей ткани кругом с помощью перманентного маркера. Этот круг поможет позже найти ткань при микроскопии. Теперь имагинальный диск глаза готов к установке в магнитную камеру для культивирования.

Чтобы закрепить имагинальный диск глаза в магнитной культуレーションной камере, с помощью пинцета захватите выступающий край покровного стекла и перенесите его на нижнюю пластину магнитной камеры с цепочечной линией, не потревожив культивируемую ткань. Затем поместите силиконовое уплотнительное кольцо на основной корпус камеры с цепочечной линией. Медленно установите основной корпус поверх нижней пластины.

Добавьте питательную среду в камеру. Добавляйте среду медленно, чтобы не нарушить состояние ткани, обеспечив при этом газообмен под крышкой. Не заполняйте камеру полностью; аккуратно поместите прозрачную крышку сверху на камеру с цепочкой.

Для визуализации мигрирующих глиальных клеток поместите культуральную камеру на предметный столик конфокального или флуоресцентного микроскопа. Найдите образец, используя круг на покровном стекле в качестве ориентира при малом увеличении. Сфокусируйтесь на образце, используя объектив с 40-кратным увеличением.

Дайте ткани осесть и делайте снимки глазного диска или зрительного нерва каждые 10–15 минут в течение трех-четырех часов при условии правильного выполнения процедуры. В результате данного протокола будет получена серия изображений меченых GFP глиальных клеток, мигрирующих из зрительного нерва в имагинальный диск глаза. В то время как прижизненной визуализации в течение 60 минут было достаточно для наблюдения за изменением положения ядер глиальных клеток в имагинальном диске глаза дикого типа, ядра глиальных клеток в мутанте по гену, необходимому для миграции глиальных клеток, полностью не смогли покинуть зрительный нерв.

Мы культивировали комплексы глаз и мозга в течение времени до 240 минут, прежде чем заметили ухудшение состояния культивируемой ткани. После временной точки 240 минут мы начинаем наблюдать GFP-положительные клетки в культуральной среде вокруг культивируемых комплексов глаз и мозга. Кроме того, GFP накапливается в виде диффузных пятен по всей ткани, что свидетельствует о нарушении целостности ткани.

Мы только что продемонстрировали вам способ культивирования имагинальных дисков для изучения миграции глиальных клеток. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.