Количественная Дрожжи Хронологический продолжительность жизни на вырост возрасте клетки

Культуры старения выдерживают в пробирках при температуре 30 градусов Цельсия при постоянном перемешивании. Био, роликовый барабан, аликвота клеток из каждой стареющей культуры инокулируется в лунку биоэкранной сотовой пластины, содержащей среду YEPD. Машина биоэкрана CMBR инкубирует и встряхивает сотовую пластину в течение 24 часов, измеряя оптическую плотность каждой лунки.

Каждые 30 минут на основе данных, полученных с помощью биоэкрана, можно создавать кривые роста, которые можно использовать для расчета жизнеспособности каждой стареющей культуры. После 24-часовой инкубации плотность клеток в сотовой пластине лунки могут варьироваться в зависимости от жизнеспособности исходной культуры для старения. Здравствуйте, я Крис Мураками из лаборатории доктора Мэтта Кэплайна и кафедры патологии Вашингтонского университета.

Сегодня мы покажем вам методику количественного определения хронологической продолжительности жизни гусей по вырастанию возрастных клеток. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения того, как генетические факторы и факторы окружающей среды влияют на продолжительность жизни дрожжей. Итак, приступим.

Для приготовления стареющих культур сначала наносят штаммы дрожжей из замороженных запасов на шнековые пластины YEPD, инкубируют клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов или до появления одиночных колоний. Как только появятся одиночные колонии, выберите одиночные колонии и внесите в них пять миллилитров YEPD. Жидкая среда.

В пробирках выращивайте культуры в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в вальцовом барабане для поддержания постоянного перемешивания после ночной инкубации, используйте по 50 микролитров каждой культуры для инокуляции пяти миллилитров синтетической полной среды. Как правило, для каждого штамма готовят три культуры СК, чтобы обеспечить тройную биологическую репликацию анализа продолжительности жизни для каждого исследуемого штамма. Поддерживайте культуру при температуре 30 градусов Цельсия с постоянным перемешиванием на роликовом барабане в течение всего эксперимента, который обычно составляет две или более недель после двух дней культивирования.

В средах СК клетки должны находиться в неподвижной фазе и первая возрастная точка готова к взятию. Последующие возрастные баллы следует сдавать каждые два-три дня в течение как минимум двух недель. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте биоскрин.

100 сотовых пластин для инокуляции, заполнение каждой лунки 145 микролитрами YEPD. Обязательно оставьте хотя бы одну лунку заполненной только с YEPD и без ячеек для последующего анализа данных. Удалите из инкубатора стареющие культуры.

Вкратце, вихревую первую культуру нужно привить в сотовую пластину. Будьте осторожны, чтобы не пролить культуру. Разожгите горлышком пробирки и удалите пять микролитров культуры, впрысните ее пипеткой в первую лунку сотовой пластины.

Не забудьте разжечь горлышко пробирки. После удаления аликвоты в пять микролитров повторяйте эту процедуру инокуляции для каждой стареющей культуры. Обязательно обратите внимание на положение лунки, соответствующее каждой культуре идентично.

Положение лунок следует использовать для каждой последующей возрастной точки на протяжении всего эксперимента. Верните культуры в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия. Когда инокуляция завершена, после того, как культуры были инокулированы в сотовую пластину, пластина загружается в машину биоэкрана CMBR.

Для этого нужно обнажить отсек инкубатора, приподняв крышку. Затем снимите крышку с лотком для образцов. Вставьте только что инокулированную сотовую пластину в лоток для образцов.

Используйте левый прорезь. Если вы читаете только одну пластину, установите на место крышку лотка для образцов и опустите крышку в отсек инкубатора. Важно убедиться, что уровень теплоносителя выше минимального уровня заполнения.

Если это не так, добавьте больше теплоносителя с помощью пипетки объемом 1000 микролитров Использование программного обеспечения биоэкрана Простой эксперимент. Установите следующие параметры для получения подходящих кривых роста для croce visi. Для количества образцов введите количество лунок с загрузкой или 200, установите фильтр на четыре 20 до пяти шириной 80 нанометров. Лента.

Установите температуру на 30 градусов по Цельсию. Продолжительность эксперимента должна быть один день, ноль часов, ноль секунд. Интервал измерения должен составлять 30 минут.

И, наконец, встряхивание должно быть установлено на непрерывное встряхивание и высокий нажатие для начала показаний. Получите выходные файлы с компьютера bio screen CMBR. Простое программное обеспечение для экспериментов выводит данные биоэкрана в виде файла с разделителями табуляции, совместимого с Microsoft Excel и другим программным обеспечением.

В первом столбце, столбце А указано время, в течение которого было произведено измерение наружного диаметра во время эксперимента. Последующие столбцы представляют каждую лунку в биоэкране, сотовые пластины, инокулированные клетками из стареющих культур. Удалите первое показание OD из каждого столбца, потому что это показание является шумом.

Нормализуйте данные, вычитая значение оптической плотности лунки только с помощью YEPD из значений оптической плотности в каждой колонке. Это устраняет поглощение фона медиасюжетом. Изгибы вырастания.

Кривые будут смещаться в зависимости от возраста, например, при построении кривых роста от первого столбца, ну, одного из сотовых пластин на шести временных точках, наблюдается отчетливое смещение кривых вправо с течением времени. Промежуток времени между начальной точкой времени, вторым днем и последующей точкой определяет жизнеспособность в этом конкретном возрасте. Рассчитайте время удвоения для каждой лунки на основе кинетики роста точки возраста второго дня.

Уравнение, используемое для вычисления времени удвоения, выглядит следующим образом, где OD 1 и OD 2 представляют последовательные измерения оптической плотности, а T 1 и T 2 — время между измерениями. Вычисляйте время удвоения только между значениями наружного диаметра от 0,2 до 0,5. Среднее из этих значений и есть время удвоения.

Что ж, большинство штаммов дрожжей дикого типа должны давать временное значение удвоения от 85 до 90 минут для каждой возрастной точки. Рассчитайте временной сдвиг дельты T на кривых вырастания относительно начальной возрастной точки, то есть второго дня. Простой способ сделать это — определить разницу в продолжительности времени, которое потребовалось каждой скважине, чтобы достичь OD 0,3 между начальной возрастной точкой и каждой последующей возрастной точкой.

Время, в течение которого конкретная скважина достигает OD 0,3, может быть рассчитано с помощью уравнения линейной регрессии, соответствующего оптической плотности естественного логарифма. Рассчитайте долю выживаемости в каждой возрастной точке, чтобы построить кривую выживаемости с начальной возрастной точкой второго дня, представляющей 100% жизнеспособность для каждой последующей возрастной точки. Рассчитайте процент выживаемости с помощью следующего уравнения.

Где SN — процент выживаемости. Delta TN — это сдвиг по времени, а Sigma N — время удвоения. Генерируйте кривые выживания по желанию для каждого из них.

Ну, построив график доли жизнеспособных клеток в зависимости от возраста, вычислите интеграл выживаемости для каждой скважины, SI определяется как площадь под кривой выживаемости и может быть оценен по этой формуле, где возраст N - возрастная точка, а SN - их значение выживаемости в этой возрастной точке, определяет статистические параметры реплицируемых лунок из СИ и данных о выживаемости. Общие статистические параметры, представляющие интерес, включают среднюю медиану и дисперсию для каждого набора биологических репликатов. Т-критерий или аналогичный анализ может быть использован для попарного сравнения СИ для различных экспериментальных и контрольных групп.

Также может быть желательно построить кривые выживаемости от средних до биологических реплик. По завершении эксперимента вы построите кривую выживаемости и проведете достаточный анализ данных, чтобы определить хронологический потенциал старения для нескольких различных штаммов или состояний. Как правило, клетки дикого типа, культивируемые в описанных здесь условиях, будут иметь среднюю хронологическую продолжительность жизни порядка семи дней.

Значительные различия в выживаемости наблюдаются у разных штаммов и при некоторых условиях, таких как рост на 0,05%Медиана выживаемости глюкозной среды может превышать 30 дней. Мы только что показали вам высокопроизводительный метод количественного определения хронологической продолжительности жизни дрожжей. Croce visier.

Важно помнить, что при выполнении этой процедуры регулярное техническое обслуживание машины биоскрининга CMBR важно как для воспроизводимости данных, так и для точности. Вот и все. Удачи в ваших экспериментах.