Ядерная передача в ооциты мыши
30 ноября 2006 г.
Этот фильм и протокол призваны помочь обучению переноса ядра.
Мы проводим перенос ядер (NU), так как наша группа интересуется репрограммированием. Это удивительный процесс, при котором дифференцированное ядро может быть репрограммировано в эмбриональное состояние. Вот реагенты case SUM и HCCV, а это — гиалуронидаза.
Сначала я подготавливаю чашку, которую затем помещают в инкубатор для выравнивания уровня CO2. Это капли, несколько капель для Тьюринга, покрытых минеральным маслом. Таким образом калибруется атмосфера с CO2.
Теперь нанесите каплю HCZB. Она будет использоваться для промывки. Раствор должен быть достаточно объемным и снова покрыт этим минеральным маслом.
Этот уровень снижается при воздействии гиалуронидазы. В этой части находятся только капли HCCP. Они предназначены для промывки.
Эта процедура предназначена для удаления клеток ulu с О-стороны. Данный этап подогревается, поэтому оборудование будет прогреваться до того момента, пока я не вернусь с образцами масел мышей и не покрою всё минеральным маслом. Здесь находятся капли PVP для очистки иглы и для помещения в них клеток, а также HCCB плюс Cyla B. И здесь я буду проводить манипуляции.
Итак, перед нами игла соответствующего цвета. Сейчас я извлекаю иглу. Хорошо, теперь у меня есть подходящая, очень тонкая игла.
А теперь перед нами микрогорн. Мне необходимо обрезать иглу в определенном месте, чтобы получить удерживающую пипетку нужного размера. Я нагреваю стеклянный шарик, опускаю иглу, пока она не расплавится и не приварится к нему, и теперь она отделена.
Я отодвигаю это. Видите, сломанная игла подходит идеально. Теперь я спускаюсь сюда и увеличиваю нагрев.
Теперь стеклянный шарик раскалится докрасна и расплавится; надавите на него, чтобы придать ему изогнутую форму. Достаточно. Я убираю его.
Как видите, затем я ввожу иглу. Мы только что поместили удерживающую пипетку в этот держатель. Теперь установите её обратно в микроскоп.
Микропипетка, капилляр, заполненный ртутью. Я загрузил её в этот наконечник. Заполните этот капилляр ртутью.
Вставьте его внутрь. Установите иглу здесь, в головке. Плотно закрутите и потяните назад.
Поворот по часовой стрелке в этом месте вытолкнет ртуть вперед, чтобы ее было видно. Теперь погружаем кончик в масло. Видите? Теперь я опускаю иглу ниже, чтобы добиться видимости.
Выпустите несколько капель ртути и втяните немного QVP. Это нормально. Затем снова поднимите его.
Я перехожу к HCCB и спускаюсь вниз по отверстию. Затем я беру P — это дозатор для мышей. Мне нужно подготовить капилляр, чтобы вставить его сюда. Спасибо. Уже готово. Хорошо.
Итак, изготовим несколько капилляров. Хорошо. И в трубку. Я Ли.
Я приехала из Швейцарии и начала эту работу год назад, когда поступила в лабораторию K и приступила к изучению метода переноса ядер. Это замечательное место, и мне очень нравится здесь работать. Разумеется, это крайне сложный эксперимент, и в процессе его выполнения может возникнуть множество проблем.
Таким образом, при начале работы вы можете столкнуться с такими проблемами, как лизис большого количества клеток во время нуклеации или переноса. Кроме того, может возникнуть ситуация, когда, несмотря на успешный перенос, клетки не развиваются. Причин этому может быть множество.
Я имею в виду, что можно начать с системы культивирования для всех участков. Таким образом, всегда необходимы определенные контроли, такие как элементы генетического контроля или некоторые оплодотворенные эмбрионы для тестирования системы культивирования и инкубаторов. Кроме того, необходимо совершенствовать навыки работы с микроскопом.
Таким образом, потребуется много практики, чтобы вы могли уверенно выполнять инакуляцию сбоку, а затем переносить образец обратно. Это вопрос навыка, и может потребоваться несколько недель или месяцев, прежде чем вы будете делать это 능но. В остальном система готова к проведению длительных экспериментов.
Поэтому рекомендуется выделить на этот процесс целый день. Кроме того, на начальном этапе сложностью может стать дозирование жидкости в лунки. Важно не допускать образования пузырьков, хорошо контролировать процесс, чтобы не потерять обзор и, что особенно важно, не повредить клон. Поскольку внешний слой, так называемая zona lucida, открыта, при дозировании можно случайно повредить клон, из-за чего он может буквально вытечь из этой zona lucida.
Также следует следить за тем, чтобы в приемной трубке не было масла. Нельзя слишком сильно всасывать или выдувать воздух, но этот навык приобретается относительно легко.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот видеоролик и протокол предназначены для обучения методу переноса ядер — процессу, при котором дифференцированное ядро перепрограммируется в эмбриональное состояние.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Перенос ядер — это метод, используемый в клонировании и регенеративной медицине.
- Перепрограммирование ядер имеет решающее значение для понимания клеточной дифференцировки.
- Этот процесс может привести к достижениям в исследованиях стволовых клеток.
- Понимание условий успешного переноса ядер необходимо для применения данного метода.
Цель исследования
- Продемонстрировать методику переноса ядер.
- Предоставить протокол, облегчающий процесс обучения.
- Изучить потенциал перепрограммирования дифференцированных клеток.
Используемые методы
- Подготовка чашки со специфическими реагентами.
- Использование гиалуронидазы в процессе переноса ядер.
- Калибровка атмосферы CO2 для создания оптимальных условий.
- Применение минерального масла для покрытия капель во время процедуры.
Основные результаты
- Успешная демонстрация метода переноса ядер.
- Использованные реагенты оказались эффективными в процессе репрограммирования.
- Установлены оптимальные условия для переноса ядер.
- Представленный протокол может быть полезен для дальнейших исследований и обучения.
Выводы
- Перенос ядер является эффективным методом репрограммирования ядер.
- Понимание методологии имеет решающее значение для её применения в исследованиях.
- Данный протокол может послужить основой для будущих исследований в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Перенос ядер позволяет перепрограммировать дифференцированные ядра в эмбриональное состояние, предоставляя механистическую модель для эпигенетического снижения рисков при валидации мишеней. Этот подход повышает прогностическую уверенность в стратегиях клеточного перепрограммирования, применимых в регенеративной медицине и терапии на основе стволовых клеток. Понимание принципов ядерного перепрограммирования способствует поиску новых терапевтических мишеней на ранних этапах, проясняя обратимость процессов дифференцировки и старения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: предоставляет систему для проверки терапевтических гипотез путем тестирования способности к ядерному репрограммированию.
- Операционная ценность: позволяет проводить функциональную валидацию мишеней посредством оценки эпигенетической обратимости в дифференцированных клетках.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля препаратов путем моделирования возможности восстановления потенциала развития в клетках, полученных от пациентов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированные условия с использованием капель, покрытых минеральным маслом, и калибровки CO2 для воспроизводимого переноса ядер.
- Количественные показатели: позволяет измерять потенциал развития в качестве функционального показателя успешности репрограммирования.
- Повторное использование платформы: поддерживает масштабируемую подготовку таких реагентов, как гиалуронидаза и SUM/HCCV, для обеспечения согласованности рабочих процессов эксперимента.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Предоставляет способ получения эмбриональных стволовых клеток, соответствующих конкретному пациенту, для моделирования заболеваний in vitro.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап репрограммирования в ходе фундаментальных исследований с доклинической валидацией посредством получения генетически идентичных стволовых клеток.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет принимать обоснованные решения о стратегиях дифференцировки и замещения стволовых клеток на основе эффективности переноса ядер.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от тестирования гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений, особенно при валидации эпигенетических механизмов и в анализах клеточного репрограммирования.
- Биология открытий: Позволяет проверить гипотезу о возможности перепрограммирования дифференцированных ядер в эмбриональное состояние.
- Скрининг: Описывает готовность анализа посредством стандартизированного приготовления капель и создания слоя минерального масла для поддержания стабильности культуры.
- Аналитика: Выделяет потенциал развития в качестве ключевого количественного показателя для сравнения условий перепрограммирования.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклинической работой, обеспечивая получение эмбриональных стволовых клеток, способных генерировать все типы клеток взрослого организма.
- Корпоративное повторное использование: Представляет перенос ядер как универсальную платформу для оценки факторов перепрограммирования в различных типах клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков при выборе эпигенетических мишеней путем демонстрации возможности ядерного репрограммирования.
- Операционная ценность: Стандартизация посредством калибровки CO2, использования минерального масла и подготовки реагентов (например, гиалуронидазы, SUM/HCCV).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в регенеративной медицине за счет ранней валидации клеточной пластичности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию подходов на основе стволовых клеток с учетом рисков, используя генетически идентичные клетки, соответствующие конкретному пациенту.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микроманипуляций, включая навыки вытягивания игл и использование микрокузницы.
- Зависит от наличия такого оборудования, как микроскопы с микроинъекторами и капилляры с ртутью для визуализации.
- Необходима стандартизация условий культивирования между исследовательскими группами, включая протоколы эквилибрации по CO2 и наложения слоя масла.
- Требуется учет особенностей адаптации при работе с различными модельными системами, особенно в отношении обращения с ооцитами и сохранения целостности zona pellucida.
- Ограничено техническими сложностями, такими как лизис клеток при переносе и нарушение развития после переноса, что требует длительной практики.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
