Ядерная передача в ооциты мыши
30 ноября 2006 г.
Этот фильм и протокол призваны помочь обучению переноса ядра.
Мы выполняем перенос ядер, так как наша группа интересуется репрограммированием. Это захватывающий процесс, при котором дифференцированное ядро может быть репрограммировано в эмбриональное состояние. Это реагенты case SUM и HCCV, а здесь — гиалуронидаза.
Сначала я подготавливаю чашку, которую затем помещу в инкубатор для выравнивания уровня CO2. Это капли, несколько капель для Тьюринга, покрытых минеральным маслом. Таким образом они калибруют атмосферу с CO2.
Теперь нанесите каплю HCZB. Она будет использоваться для промывки. Раствор содержит высокую концентрацию декстрана и снова покрыт минеральным маслом.
Здесь уровень высокий, он снижается при добавлении гиалуронидазы. В этой части находятся только капли HCCP. Они предназначены для промывки.
Это необходимо для удаления клеток ulu с О-стороны. Данный этап подогревается, поэтому он будет прогреваться до того момента, пока я не вернусь, чтобы взять мазки масла у мышей и покрыть всё минеральным маслом. Здесь находятся капли PVP для очистки иглы и для помещения в них клеток, а здесь — HCCB плюс Cyla B. И здесь я буду проводить манипуляции.
Итак, здесь мы видим цвет иглы. Сейчас я извлекаю иглу. Теперь у меня есть подходящая, очень тонкая игла.
А теперь перед нами микрогорн. Мне необходимо обрезать иглу в определенном месте, чтобы получить удерживающую пипетку подходящего размера. Я нагреваю стеклянный шарик, прижимаю к нему иглу до расплавления, и теперь она отломана.
Я отодвигаю это. Видите, сломанная игла подходит идеально. Теперь я спускаюсь сюда и увеличиваю нагрев.
Теперь стеклянный шар станет красным и начнет плавиться; надавив на стеклянный шар, я придам ему изогнутую форму. Достаточно. Я убираю его.
Затем я ввожу иглу. Мы только что установили удерживающую пипетку в этот держатель. Теперь вставьте его обратно в микроскоп.
Микропипетка, капилляр, заполненный ртутью. Я заполнил этот наконечник. Заполните этот капилляр ртутью.
Оно вставляется внутрь. Установите иглу здесь, в этом головном элементе. Плотно закрутите и потяните назад.
Поворот по часовой стрелке вытолкнет ртуть вперед, чтобы ее было видно. Теперь опустите кончик в масло. Видите? Теперь я перемещаю иглу вниз, чтобы настроить видимость.
Выдавите несколько капель ртути и втяните немного QVP. Это нормально. Затем снова переместите его вверх.
Я подхожу к HCCB и перемещаюсь вниз по отверстию. Моя голова направлена к P, где находится дозатор для мышей. Мне нужно подготовить капилляр, чтобы вставить его сюда. Спасибо. Уже готово. Хорошо.
Итак, изготовим капилляр. Хорошо. И в трубку. Я добавляю раствор щелочи.
Я приехал из Швейцарии и начал эту работу год назад, когда пришел в лабораторию K'S и начал изучать перенос ядер. Это действительно прекрасное место, и здесь очень здорово работать. И, конечно, это очень сложный эксперимент, в ходе которого может возникнуть множество проблем.
Таким образом, в начале работы вы можете столкнуться с такими проблемами, как лизис большого количества клеток в процессе нуклеации или переноса. Также может оказаться, что даже при успешном переносе клетки не развиваются. Причин этому может быть множество.
Я имею в виду, что можно начать с системы культивирования для всех участков. Таким образом, всегда требуются контроли, такие как компоненты генетического контроля или некоторые оплодотворенные эмбрионы, чтобы протестировать систему культивирования и инкубаторы. Кроме того, необходимо совершенствовать навыки работы с микроскопом.
Таким образом, потребуется много практики, прежде чем вы сможете уверенно выполнять инокуляцию с края и последующий перенос обратно. Это вопрос навыка, и может пройти несколько недель или месяцев, прежде чем вы в этом освоитесь. В остальном система готова к проведению длительных экспериментов.
Поэтому рекомендуется выделить на этот процесс целый день. Также на начальном этапе может возникнуть сложность с дозированием жидкостей пипеткой. Важно не создавать пузырьки воздуха, хорошо контролировать процесс, чтобы не потерять обзор или, что особенно критично, не повредить клон; поскольку внешний слой соналюцита открыт, при использовании пипетки можно случайно повредить клон, в результате чего он может вытечь из соналюцита.
Также необходимо следить за тем, чтобы в этой трубке не было масла. Не следует слишком сильно втягивать или выдувать воздух, но этот навык приобретается относительно легко.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот видеоролик и протокол предназначены для обучения методу переноса ядер — процессу, при котором дифференцированное ядро перепрограммируется в эмбриональное состояние.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Перенос ядер — это метод, используемый в клонировании и регенеративной медицине.
- Перепрограммирование ядер имеет решающее значение для понимания клеточной дифференцировки.
- Этот процесс может привести к достижениям в исследованиях стволовых клеток.
- Понимание условий успешного переноса ядер необходимо для применения данного метода.
Цель исследования
- Продемонстрировать методику переноса ядер.
- Предоставить протокол, облегчающий процесс обучения.
- Изучить потенциал перепрограммирования дифференцированных клеток.
Используемые методы
- Подготовка чашки со специфическими реагентами.
- Использование гиалуронидазы в процессе переноса ядер.
- Калибровка атмосферы CO2 для создания оптимальных условий.
- Применение минерального масла для покрытия капель во время процедуры.
Основные результаты
- Успешная демонстрация метода переноса ядер.
- Использованные реагенты оказались эффективными в процессе репрограммирования.
- Установлены оптимальные условия для переноса ядер.
- Представленный протокол может быть полезен для дальнейших исследований и обучения.
Выводы
- Перенос ядер является эффективным методом репрограммирования ядер.
- Понимание методологии имеет решающее значение для её применения в исследованиях.
- Данный протокол может послужить основой для будущих исследований в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Перенос ядер позволяет перепрограммировать дифференцированные ядра в эмбриональное состояние, предоставляя механистическую модель для эпигенетического снижения рисков при валидации мишеней. Этот подход повышает прогностическую уверенность в стратегиях клеточного перепрограммирования, применимых в регенеративной медицине и терапии на основе стволовых клеток. Понимание принципов ядерного перепрограммирования способствует поиску новых терапевтических мишеней на ранних этапах, проясняя обратимость процессов дифференцировки и старения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: предоставляет систему для проверки терапевтических гипотез путем тестирования способности к ядерному репрограммированию.
- Операционная ценность: позволяет проводить функциональную валидацию мишеней посредством оценки эпигенетической обратимости в дифференцированных клетках.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля препаратов путем моделирования возможности восстановления потенциала развития в клетках, полученных от пациентов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированные условия с использованием капель, покрытых минеральным маслом, и калибровки CO2 для воспроизводимого переноса ядер.
- Количественные показатели: позволяет измерять потенциал развития в качестве функционального показателя успешности репрограммирования.
- Повторное использование платформы: поддерживает масштабируемую подготовку таких реагентов, как гиалуронидаза и SUM/HCCV, для обеспечения согласованности рабочих процессов эксперимента.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Предоставляет способ получения эмбриональных стволовых клеток, соответствующих конкретному пациенту, для моделирования заболеваний in vitro.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап репрограммирования в ходе фундаментальных исследований с доклинической валидацией посредством получения генетически идентичных стволовых клеток.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет принимать обоснованные решения о стратегиях дифференцировки и замещения стволовых клеток на основе эффективности переноса ядер.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от тестирования гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений, особенно при валидации эпигенетических механизмов и в анализах клеточного репрограммирования.
- Биология открытий: Позволяет проверить гипотезу о возможности перепрограммирования дифференцированных ядер в эмбриональное состояние.
- Скрининг: Описывает готовность анализа посредством стандартизированного приготовления капель и создания слоя минерального масла для поддержания стабильности культуры.
- Аналитика: Выделяет потенциал развития в качестве ключевого количественного показателя для сравнения условий перепрограммирования.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклинической работой, обеспечивая получение эмбриональных стволовых клеток, способных генерировать все типы клеток взрослого организма.
- Корпоративное повторное использование: Представляет перенос ядер как универсальную платформу для оценки факторов перепрограммирования в различных типах клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков при выборе эпигенетических мишеней путем демонстрации возможности ядерного репрограммирования.
- Операционная ценность: Стандартизация посредством калибровки CO2, использования минерального масла и подготовки реагентов (например, гиалуронидазы, SUM/HCCV).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в регенеративной медицине за счет ранней валидации клеточной пластичности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию подходов на основе стволовых клеток с учетом рисков, используя генетически идентичные клетки, соответствующие конкретному пациенту.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микроманипуляций, включая навыки вытягивания игл и использование микрокузницы.
- Зависит от наличия такого оборудования, как микроскопы с микроинъекторами и капилляры с ртутью для визуализации.
- Необходима стандартизация условий культивирования между исследовательскими группами, включая протоколы эквилибрации по CO2 и наложения слоя масла.
- Требуется учет особенностей адаптации при работе с различными модельными системами, особенно в отношении обращения с ооцитами и сохранения целостности zona pellucida.
- Ограничено техническими сложностями, такими как лизис клеток при переносе и нарушение развития после переноса, что требует длительной практики.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
