Объединение периферического нерва Пересадка и Матрица модуляции Ремонт Травмированные Крыса спинного мозга

Подготовка к пересадке периферического нерва в место повреждения спинного мозга начинается с предварительной дегенерации ПН за семь-десять дней до трансплантации. Пересекают ветвь большеберцового нерва крысы-донора. Путем аспирации выполняется гемисекция на уровне пятого шейного сегмента (C5).

PNG извлекают из крысы-донора, прикладывают к ростральной стенке полости повреждения и фиксируют путем пришивания к твердой мозговой оболочке. Через три недели в сегменте C7 создают повреждение в дорсальном квадранте; в полость на 15 минут помещают гель-губку, насыщенную C-H-A-B-C, для расщепления протеогликанов глиального рубца. Через два дня C-H-A-B-C вводят микроинъекцией рядом с местом повреждения, а дистальный конец PNG прикладывают к месту повреждения в дорсальном квадранте.

Здравствуйте, я Джон Хула. Я директор Исследовательского центра повреждений спинного мозга в Медицинском колледже Университета Дрекселя. Я доктор Вероника Том из лаборатории Хулы, а я Марта Мин.

Из лаборатории hula. Сегодня мы продемонстрируем процедуру трансплантации сегмента периферического нерва в поврежденный спинной мозг взрослой крысы. В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения регенерации аксонов и восстановления функций после травмы спинного мозга.

Итак, приступим. Для подготовки к микрохирургической операции продезинфицируйте хирургический стол и простерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве. Подготовьте тепловой барьер и небольшие кусочки гельфома размером менее 2 мм³ для микрогемостаза.

Подготовьте ватные палочки, марлевые салфетки и хирургические инструменты. Поместите anesthetized крысу на операционный стол, предварительно убедившись в полноте анестезии путем зажима пальца лапы. Выбрейте шерсть на обширном участке предполагаемого операционного поля и промойте место разреза, следуя методу асептической обработки кожи, описанному в сопровождающем текстовом протоколе.

Затем поместите крысу на термоизоляционный коврик, накройте нос и рот ингаляционным конусом, снизьте концентрацию изофлурана до 3% и скорость потока до 0,2 литров в минуту. Введите соответствующую дозу антибиотика ампициллина подкожно и анальгетика бупренорфина внутримышечно. Периферический нерв (PN) пересекают за семь-десять дней до его извлечения для стимуляции дегенерации, что создает среду, более подходящую для роста аксонов, чем свежий препарат нерва.

Для начала перерезки седалищного нерва положите животное на бок. Наденьте стерильные перчатки и зафиксируйте стерильную хирургическую салфетку вокруг области операции. Сделайте прямой разрез от головки бедренной кости до колена, двигаясь параллельно бедренной кости на расстоянии примерно трех миллиметров от нее; рассеките поверхностные мышцы двуглавой мышцы бедра по той же линии, что и разрез кожи, чтобы обнажить подлежащую латеральную широкую мышцу бедра.

После обнажения латеральной широкой мышцы бедра с помощью ножниц сделайте небольшой разрез в ней рядом с коленом и продлите его вверх к головке бедренной кости. Осторожно раздвиньте латеральную широкую мышцу ретракторами до тех пор, пока не будут визуализированы соединенные большеберцовая и малоберцовая ветви седалищного нерва, проходящие параллельно бедренной кости. Затем проследите за этими ветвями нерва в направлении головки бедренной кости до тех пор, пока не будет идентифицирован основной ствол седалищного нерва.

Сразу под бифуркацией седалищного нерва с помощью тонкого пинцета осторожно отделите соединительную ткань или эпиневрий, окружающий ветвь большеберцового нерва. Это более крупная ветвь. После изоляции ветви большеберцового нерва наложите на нее шелковую лигатуру 6-0 и затяните.

С помощью микроножниц пересеките нервный ствол до места наложения лигатуры. Проведите шовную нить через латеральную широкую мышцу бедра (vastus lateralis) и завяжите узел. Это создаст маркер для легкого поиска обрезанного конца большеберцового нерва.

После извлечения нерва зашейте латеральную широкую мышцу бедра шелковым шовным материалом 6-0. Затем зашейте двуглавую мышцу плеча шелковым шовным материалом 6-0.

Наконец, закройте кожу с помощью зажимов для ран Мишеля. Выключите подачу изофлурана и снимите ингаляционный носовой конус. Поместите животное в клетку для содержания на термобарьер.

Верните животное в домашнюю клетку. Через 7–10 дней, когда животное станет бдительным и активным, сегмент PN будет готов к забору. Для начала трансплантации поместите анестезированное животное на термобарьер.

После подтверждения того, что животное полностью находится под воздействием анестезии, снимите зажимы с раны и разведите края разреза кожи. Предварительное бритье области может не потребоваться, так как кожа должна легко разойтись, что позволит избежать контаминации. Чтобы не прорезать шерсть, сделайте разрез шва поверхностной мышцы для обнажения латеральной широкой мышцы бедра (vastus lateralis), а затем рассеките шов в этой мышце.

Проследите по линии шва до обрезанного конца большеберцового нерва и удалите шовный материал из нерва. С помощью тонкого пинцета препарируйте эпиневралий на участке большеберцового нерва длиной 15 millimeter и перережьте этот дистальный конец. Извлеките сегмент нерва и погрузите его в стерильный сбалансированный солевой раствор Хэнкса.

Теперь мы готовы к следующему этапу, который заключается в нанесении травмы спинного мозга для последующей трансплантации PN; трансплантация может быть аутологичной или гетерологичной. Поместите анестезированную крысу на термобарьер, введите антибиотики и анальгетики, как описано в предыдущем разделе, чтобы вызвать гемисекцию спинного мозга. Сначала найдите затылочную вырезку и выступающий дорсальный остистый отросток второго грудного позвонка (T2).

Сделайте разрез на всю длину между этими внешними ориентирами. Разрежьте по срединной линии поверхностную часть трапециевидной мышцы и разделите расположенные под ней мышцы шеи. Вставьте расширитель, чтобы удерживать мышцы в разведенном состоянии.

Глубокие супраспинальные мышцы следует отсечь от дорсальных отростков C4, C5 и C6 позвонков. С помощью микрохирургических ножниц выполните частичную ламинэктомию C5, чтобы обнажить всю правую сторону и медиальную часть левой стороны спинного мозга. В качестве ориентира для определения срединной линии спинного мозга используйте выраженную дорсальную вену.

Затем с помощью лезвия микроскальпеля проколите твердую мозговую оболочку и продлите разрез над спинным мозгом на уровне C5. С помощью вытянутой стеклянной микроканюли сделайте небольшой разрез в подлежащей субарахноидальной и мягкой мозговых оболочках. Начните аспирацию дорсальной правой стороны спинного мозга, используя осторожное давление и микропинцет для отделения ткани и облегчения ее удаления.

Продолжайте движение через промежуточную и вентральную части спинного мозга, чтобы создать полость длиной 2 мм, проходящую полностью от дорсальной до вентральной поверхности и от срединной линии до латеральных мозговых оболочек. Поместите в полость повреждения гемисекции гемостатическую губку, смоченную в физиологическом растворе. Для достижения гемостаза из раствора Хэнка извлеките предварительно заготовленный сегмент периферического нерва.

Осторожно зафиксируйте эпиневральную оболочку на проксимальных трех миллиметрах сегмента нерва и приложите этот конец к ростральной стенке полости повреждения в сечении HEMI. Закрепите сегмент, наложив 10 швов через эпиневральную оболочку к твердой мозговой оболочке. Затем зашейте твердую мозгую оболочку над имплантированным концом трансплантата, зажав его между двумя фрагментами эластичной мембраны cel.

Разместите трансплантат вдоль отростков позвонков C6, C7 и T1. Не прижимайте дистальный конец нерва к спинному мозгу или мышечной ткани. Послойно ушейте мышцы швом 4-0 и закройте разрез кожи с помощью хирургических скоб.

Наконец, поместите животное в клетку для временного содержания на термобарьер, а затем верните его в домашнюю клетку. После того как животное станет бдительным и активным, регенерированные аксоны, достигшие дистального конца трансплантата периферического нерва (PN), часто не могут снова проникнуть в спинной мозг. Поэтому мы используем микроинъекции хондроитиназы AC для деградации рубцовой ткани, окружающей область повреждения.

Данную процедуру проводят через 21 день после трансплантации PN; прежде всего убедитесь, что животное полностью находится под воздействием анестетика. Затем снимите зажимы с раны и введите антибиотики и анальгетики, как было показано ранее. С помощью тонкого пинцета и пружинных ножниц рассеките поверхностные швы, чтобы обнажить эластическую мембрану, окружающую нервный трансплантат.

Осторожно освободите участок нерва от эластических оболочек. Отведите нерв из операционного поля. Выполните частичную ламинэктомию с правой стороны остистого отростка седьмого шейного позвонка (C7).

Проколите мозговые оболочки лезвием микроскальпеля и путем аспирации сформируйте в дорсальном квадранте спинного мозга на уровне C7 полость повреждения размером 1 мм³. Поместите в полость повреждения гель-губку, смоченную в физиологическом растворе, для достижения гемостаза. После этого замените её гель-губкой, смоченной в растворе хондроитинсульфата натрия.

A BC. Обрабатывайте место повреждения в течение 15 минут, каждые пять минут заменяя гель-губку, пропитанную свежим хондроитином. Покройте внешнюю часть нервного транспланта шоластической мембраной. Ушейте поверхностные мышцы швом 4-0, а разрез кожи закройте хирургическими скобами.

Поместите животное в клетку для временного содержания на термобарьер, а после того как оно станет активным и придет в сознание, верните его в домашнюю клетку. Через два дня, то есть на 23-й день после трансплантации PN, животному повторно проводят хирургическую операцию для микроинъекции хондроитин NA в спинной мозг. Как и ранее, у анестезированного животного удаляют зажимы раны, вводят антибиотики и анальгетики.

Рассеките поверхностные швы, чтобы обнажить эластичную мембрану, окружающую нервный трансплантат. Обнажите место установки трансплантата C7, не затрагивая сам трансплантат. Затем с помощью шприца Hamilton со стеклянной канюлей с зауженным концом проведите микроинъекцию 1 µL хондроитинсульфата AC в правую сторону спинного мозга, примерно в 1 mm дистальнее места прилегания трансплантата к спинному мозгу.

Осторожно отделите EUR от дистальных двух миллиметров сегмента нерва и приложите этот конец к полости поражения C seven. Закрепите сегмент с помощью швов 10-0, проходящих через эпиневрий в твердую мозговую оболочку. Ушейте поверхностные мышцы швами 4-0, а разрез кожи закройте хирургическими скобами.

Поместите животное в клетку для содержания на термобарьер и верните его в домашнюю клетку, как только оно станет бдительным и активным. При оптимизации данной процедуры сегмент периферического нерва тесно интегрируется со спинным мозгом реципиента, что позволяет визуализировать спинномозговые аксоны, регенерирующие в трансплантат. Мы заполнили трансплантат методом диффузии биотинилированным декстринамином (BDA) в восходящих и нисходящих путях.

Аксоны спинного мозга, как правило, входят в трансплантат, растут относительно прямой линией параллельно его длине и достигают дистального конца трансплантата со скоростью примерно один миллиметр в день. Аксоны периферических нервов проникают в прилежащий спинной мозг. При использовании хондроитиназаС для удаления ингибирующих протеогликанов из окружающей рубцовой ткани, после достижения дистального конца лишь очень немногие аксоны периферических нервов прорастают в ткани реципиента после обработки растворителем.

Однако, если дистальный интерфейс обрабатывали хондроитином, из транспланта выходило значительно больше аксонов для реиннервации спинного мозга. Как показано здесь на одном репрезентативном срезе из 15–20 срезов на животное, на которых наблюдается рост аксонов, данная гистограмма демонстрирует значительное увеличение роста аксонов после комбинированного лечения A BC. Для оценки функциональной связности между пересаженным трансплантатом и спинным мозгом реципиента можно использовать иммунохимическое определение синаптических маркеров в нейронах спинного мозга в ответ на электрическую стимуляцию аксонов внутри трансплантата.

Данный участок спинного мозга, содержащий место дистального прилегания, был подвергнут иммуноцитохимическому окрашиванию как на биотинилированный декстрин-амин (зеленый цвет), так и на синаптический маркер синапсин; красными стрелками indicated области колокализации маркеров, что указывает на формирование функциональных синаптических контактов некоторыми волокнами, регенерировавшими из трансплантата. Функциональная связь между нейронами трансплантата и спинного мозга также была продемонстрирована путем анализа экспрессии CFOs. После синаптической стимуляции нейронов реципиента за пределами дистального интерфейса этот маркер транссинаптической активации обнаруживается по многочисленным CFOs-положительным нейронам в ткани ипсилатерально месту трансплантации, тогда как при большем увеличении в ткани контралатерально трансплантату наблюдается очень мало CFOs-положительных нейронов.

Мы только что продемонстрировали вам, как подготовить место повреждения спинного мозга к трансплантации графта периферического нерва для стимуляции регенерации после травмы спинного мозга. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости обеспечения достаточной длины нерва перед трансплантацией, а также о плотном прилегании графта к месту повреждения спинного мозга. На этом всё.

Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.