Объединение периферического нерва Пересадка и Матрица модуляции Ремонт Травмированные Крыса спинного мозга

Подготовка к пересадке периферического нерва в место повреждения спинного мозга начинается с предварительной дегенерации периферического нерва за семь-десять дней до трансплантации. Ветвь большеберцового нерва крысы-донора пересекают. Выполняют гемисекцию на уровне пятого шейного сегмента (C5) методом аспирации.

PNG извлекают из крысы-донора, совмещают с ростральной стенкой полости повреждения и фиксируют путем пришивания золотой нитью к твердой мозговой оболочке. Через три недели создают повреждение в дорсальном квадранте на уровне C7; в полость на 15 минут помещают гель-губку, насыщенную C-H-A-B-C, для расщепления протеогликанов глиального рубца. Спустя два дня C-H-A-B-C вводят микроинъекцией рядом с местом повреждения, а дистальный конец PNG совмещают с повреждением в дорсальном квадранте.

Здравствуйте, я Джон Хула, директор Центра исследований травм спинного мозга в Медицинском колледже Университета Дрекселя. Я доктор Вероника Том из лаборатории Хула, а я — Марта Мин.

Из лаборатории hula. Сегодня мы продемонстрируем процедуру трансплантации сегмента периферического нерва в поврежденный спинной мозг взрослой крысы. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения регенерации аксонов и восстановления функций после травмы спинного мозга.

Итак, приступим. Для подготовки к микрохирургической операции продезинфицируйте операционную зону и простерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве. Подготовьте термобарьер и небольшие кусочки гелевой губки размером менее 2 мм³ для микрогемостаза.

Подготовьте ватные палочки, марлевые салфетки и хирургические инструменты. Поместите анестезированную крысу на операционный стол, предварительно убедившись в полном погружении животного в наркоз с помощью щипкового теста (сжатия пальца лапы). Выбрейте шерсть на широком участке предполагаемого операционного поля, после чего обработайте место операции в соответствии с методикой асептического мытья, описанной в сопроводительном текстовом протоколе.

Далее поместите крысу на термоизоляционный коврик, накройте нос и рот ингаляционным конусом, снизьте концентрацию изофлурана до 3% и скорость потока до 0,2 литров в минуту. Введите соответствующую дозу антибиотика ампициллина подкожно и анальгетика бупренорфина внутримышечно. Периферический нерв (ПН) пересекают за 7–10 дней до его извлечения для стимуляции дегенерации, что создает среду, более подходящую для роста аксонов, чем свежий препарат нерва.

Чтобы начать перерезание седалищного нерва, положите животное на бок. Наденьте стерильные перчатки и зафиксируйте стерильную хирургическую салфетку вокруг места проведения операции. Сделайте разрез прямой линией от головки бедренной кости до коленного сустава, двигаясь параллельно и примерно в трех миллиметрах от бедренной кости; рассеките поверхностные мышцы двуглавой мышцы бедра по той же линии, что и разрез кожи, чтобы обнажить подлежащую латеральную широкую мышцу бедра.

После обнажения латеральной широкой мышцы бедра (vastus lateralis) с помощью ножниц сделайте небольшой разрез в мышце рядом с коленом и продлите его вверх по направлению к головке бедренной кости. Осторожно раздвиньте латеральную широкую мышцу ретракторами до тех пор, пока не визуализируются соединенные тибиальные и малоберцовые ветви седалищного нерва, проходящие параллельно бедренной кости. Затем проследите за этими нервными ветвями в направлении головки бедренной кости до момента обнаружения основного ствола седалищного нерва.

Сразу под бифуркацией седалищного нерва с помощью тонкого пинцета осторожно отделите соединительную ткань или эпиневрай, окружающий ветвь большеберцового нерва. Это более крупная ветвь. После изоляции большеберцового нерва наложите вокруг него шелковую лигатуру 6-0 и затяните ее.

Используя микрохирургические ножницы, перережьте нерв на уровне проксимальнее лигатуры. Проведите шовную нить через латеральную широкую мышцу бедра (vastus lateralis) и завяжите узел. Это позволит легко обнаружить срезанный конец большеберцового нерва.

После извлечения нерва зашейте латеральную широкую мышцы бедра швом из шелка 6-0. Затем зашейте двуглавую мышцу плеча швом из шелка 6-0.

Наконец, закройте кожу с помощью зажимов для ран Michelle. Прекратите подачу изофлурана и снимите ингаляционную носовую маску. Поместите животное в клетку для содержания на термобарьер.

Верните животное в домашнюю клетку. Через семь-десять дней, когда животное станет бдительным и активным, сегмент периневрального нерва (PN) будет готов к извлечению. Для начала трансплантации поместите анестезированное животное на термобарьер.

После подтверждения полной анестезии животного снимите зажимы с раны и раздвиньте края кожного разреза. Предварительное бритье области может не потребоваться, так как кожа должна легко разойтись, что позволит избежать контаминации. Чтобы не прорезать шерсть, сделайте разрез через шов поверхностной мышцы для обнажения m. vastus lateralis, а затем разрежьте шов в этой мышце.

Проследите по линии шва до обрезанного конца большеберцового нерва и удалите шовный материал из нерва. С помощью тонкого пинцета препарируйте эпиневралий на участке большеберцового нерва длиной 15 millimeter и перережьте этот дистальный конец. Извлеките сегмент нерва и погрузите его в стерильный сбалансированный солевой раствор Хэнкса.

Теперь мы готовы к следующему этапу, который заключается в нанесении травмы спинного мозга для последующей трансплантации PN; трансплантация может быть аутологичной или гетерологичной. Поместите анестезированную крысу на термобарьер, введите антибиотики и анальгетики, как описано в предыдущем разделе, чтобы вызвать гемисекцию спинного мозга. Сначала найдите затылочную вырезку и выраженный дорсальный остистый отросток второго грудного позвонка (T2).

Выполните разрез на всю длину между этими внешними ориентирами. Разрежьте поверхностную трапециевидную мышцу по срединной линии и разделите лежащие под ней глубокие мышцы шеи. Вставьте распорку, чтобы раздвинуть мышцы.

Глубокие супраспинальные мышцы следует отсечь от дорсальных отростков четвертого, пятого и шестого шейных позвонков (C4, C5 и C6). С помощью микрохирургических ножниц выполните частичную ламинэктомию C5, чтобы обнажить всю правую сторону и медиальную часть левой стороны спинного мозга. В качестве ориентира для определения средней линии спинного мозга используйте выраженную дорсальную вену.

Затем с помощью лезвия микроскальпеля проколите твердую мозговую оболочку и продлите разрез над спинным мозгом на уровне пятого шейного сегмента (C5). С помощью вытянутой стеклянной микроканюли сделайте небольшой разрез в подлежащей субарахноидальной и мягкой мозговой оболочках. Начните аспирацию дорзальной правой стороны спинного мозга, используя осторожное давление и микропинцет для разделения ткани и облегчения ее удаления.

Продолжайте движение через промежуточные и вентральные отделы спинного мозга, чтобы создать полость длиной два миллиметра, проходящую полностью от дорсальной до вентральной поверхности и от срединной линии до латеральных мозговых оболочек. Поместите в полость повреждения в сегменте HEMI гель-губку, пропитанную физиологическим раствором. Для достижения гемостаза избавьте ранее заготовленный сегмент периферического нерва из раствора Хенкса.

Осторожно приподнимите эпиневральный слой в проксимальных трех миллиметрах сегмента нерва и приложите этот конец к ростральной стенке полости повреждения в месте секции HEMI. Закрепите сегмент, наложив 10 швов через эпиневральный слой к твердой мозговой оболочке. Затем зашейте твердую мозговую оболочку над имплантированным концом трансплантата, зажав его между двумя кусочками эластичной мембраны из целлюлозы.

Поместите трансплантат вдоль остистых отростков шестого и седьмого шейных (C6, C7) и первого грудного (T1) позвонков. Не прижимайте дистальный конец нерва к спинному мозгу или мышечной ткани. Послойно зашейте мышцы швами 4-0 и закройте разрез кожи хирургическими скобками.

Наконец, поместите животное в клетку для содержания на термоизоляционном барьере, а затем верните его в домашнюю клетку. После того как животное станет бдительным и активным, регенерированные аксоны, достигшие дистального конца трансплантата периферического нерва (PN), часто не могут снова проникнуть в спинной мозг. Поэтому мы используем микроинъекции хондроитиназы ABC для разрушения рубцовой ткани, окружающей область повреждения.

Данную процедуру проводят через 21 день после трансплантации PN; для начала убедитесь, что животное полностью находится под воздействием анестезии. Затем снимите зажимы с раны и введите антибиотики и анальгетики, как было показано ранее. С помощью тонкого пинцета и пружинных ножниц рассеките поверхностные швы, чтобы обнажить эластическую мембрану, окружающую нервный трансплантат.

Осторожно освободите отрезок нерва от эластичных оболочек. Отодвиньте нерв от операционного поля. Выполните частичную ламинэктомию справа в области отростка седьмого шейного позвонка (C7).

Проколите мозговые оболочки лезвием микроскальпеля и путем аспирации сформируйте полость повреждения в дорсальном квадранте спинного мозга на уровне C семь объемом один милликубический миллиметр. Поместите в полость повреждения пропитанную физраствором гель-губку для достижения гемостаза. После этого замените гель-губку на губку, пропитанную хондроитинсульфатом натрия.

А BC. Обрабатывайте место повреждения в течение 15 минут, обновляя гель-губку, пропитанную хондроитином, каждые пять минут. Покройте внешнюю длину нервного транспланта шоластической мембраной. Ушейте поверхностные мышцы швом 4-0, а разрез кожи закройте атравматичными скобами.

Поместите животное в клетку для содержания на термобарьер и верните его в домашнюю клетку, как только оно станет бдительным и активным. Через два дня, на 23-й день после трансплантации PN, животному повторно проводят хирургическую операцию для микроинъекции хондроитин NA в спинной мозг. Как и ранее, у анестезированного животного удаляют зажимы раны, вводят антибиотики и анальгетики.

Перережьте поверхностные швы, чтобы обнажить эластичную мембрану, окружающую трансплантат нерва. Обнажите место трансплантации C7, не затрагивая сам трансплантат. Затем с помощью шприца Hamilton с вытянутой стеклянной канюлей проведите микроинъекцию 1 µL хондроитинсульфата AC в правую сторону спинного мозга, примерно в 1 мм дистальнее места прилегания трансплантата к спинному мозгу.

Осторожно очистите EUR от дистальных двух миллиметров сегмента нерва и приложите этот конец к полости поражения C семь. Закрепите сегмент с помощью швов 10-0, прошивая эпиневрий и прикрепляя его к твердой мозговой оболочке. Ушейте поверхностные мышцы швами 4-0, а разрез кожи закройте хирургическими скобами.

Поместите животное в клетку для содержания на тепловой барьер и верните его в домашнюю клетку, когда оно станет бдительным и активным. После оптимизации данной процедуры сегмент периферического нерва тесно интегрируется со спинным мозгом реципиента, что позволяет визуализировать спинальные аксоны, регенерирующие в трансплантат. Мы заполнили трансплантат путем диффузии биотинилированным декстрин-амином (BDA) в восходящем и нисходящем направлениях.

Аксоны спинного мозга обычно входят в трансплантат, растут относительно прямолинейно параллельно его длине и достигают дистального конца трансплантата со скоростью примерно один миллиметр в день. Аксоны периферических нервов проникают в прилегающий спинной мозг. Если для удаления ингибирующих протеогликанов из окружающей рубцовой ткани использовался хондроитин NACE, то при достижении дистального конца лишь очень немногие аксоны периферических нервов прорастают в ткани реципиента после обработки препаратом по сравнению с контролем (vehicle).

Однако, если дистальный интерфейс обрабатывали хондроитином, из транспланта выходит значительно больше аксонов для реиннервации спинного мозга. Как показано здесь на одном репрезентативном срезе из 15–20 срезов на животное, где наблюдается рост аксонов, эта столбчатая диаграмма демонстрирует значительное увеличение роста аксонов после обработки conjoin nace A BC. Для оценки функциональной связи между пересаженным трансплантатом и спинным мозгом реципиента может быть использовано иммунохимическое определение синаптических маркеров в нейронах спинного мозга в ответ на электрическую стимуляцию аксонов внутри трансплантата.

Данный участок спинного мозга, содержащий дистальный сайт прилегания, был подвергнут иммунноцитохимическому окрашиванию как на биотинилированный декстрин-амин (зеленый цвет), так и на синаптический маркер синапсин; красные стрелки указывают на области колокализации маркеров, что свидетельствует о том, что часть волокон, регенерировавших из трансплантата, образовали функциональные синаптические контакты. Функциональная связь между нейронами трансплантата и спинного мозга была также продемонстрирована путем анализа экспрессии CFOs. После синаптической стимуляции нейронов реципиента за пределами дистального интерфейса этот маркер транссинаптической активации обнаруживается в виде множества CFOs-положительных нейронов в ткани ипсилатерально по отношению к месту трансплантации, тогда как при большем увеличении в ткани контралатерально по отношению к трансплантату наблюдается очень мало CFOs-положительных нейронов.

Мы только что продемонстрировали вам, как подготовить место повреждения спинного мозга к трансплантации графта периферического нерва для стимуляции регенерации после травмы спинного мозга. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости обеспечения достаточной длины нерва перед трансплантацией и плотного прилегания графта к месту повреждения спинного мозга. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.