In Vitro Раздражение кожи испытаний (ГСИ), используя эпидермиса реконструкции человеческого эпидермального (RHE) Модель

Эпидерм — это нормальная человеческая клетка, полученная из реконструированной in vitro модели эпидермиса человека, разработанная корпорацией Matt Tech. Валидированный EC VM протокол испытаний на раздражение кожи эпидермии заменяет традиционное тестирование на животных продуктов, таких как косметика, сырье и промышленные агенты, которые будут контактировать с кожей человека. Этот тест начинается в нулевой день, когда набор для раздражения кожи и ткань эпидермиса прибывают в лабораторию, а затем предварительно подготавливаются в среду для анализа после ночной инкубации.

В первый день атипичная поверхность ткани эпидермиса подвергается воздействию в течение одного часа предполагаемым раздражителем, а затем раздражитель удаляется с помощью промывки на второй день. После 24-часовой инкубации культуральный вкладыш помещают в свежую среду, и старая среда может быть использована для анализа высвобождаемых цитокинов и хемокинов. Ткань вступает в реакцию с соединением, известным как МТТ, которое преобразуется митохондриальной редуктазой в темно-фиолетовый цвет для маоза и соли.

Предоставление данных о жизнеспособности клеток. Недостаток темно-фиолетового цвета в образце является показателем сниженной жизнеспособности. И когда показания метрики calor для тестируемого соединения составляют менее 50% от отрицательного контроля, тестируемое соединение можно классифицировать как раздражающее.

Здравствуйте, я Хелена Кава из Matt Corporation. Сегодня мы покажем вам процедуру тестирования на раздражение кожи in vitro с использованием реконструированной модели эпидермиса кожи человека. Данная процедура, в зависимости от нормативных требований, может быть использована в качестве полной или частичной замены экспресс-теста на раздражение кожи in vivo.

Эта новая процедура in vitro может быть использована для идентификации опасностей и маркировки химических веществ и косметического сырья. Итак, приступим. Epiderm получают из культуры эпидермальных кератиноцитов человека для формирования трехмерной, многослойной и высокодифференцированной модели эпидермиса человека.

Ткани митотически и метаболически активны, близко имитируют свои аналоги in vivo как структурно, так и биохимически, и делают это с гарантированной воспроизводимостью, как эпидермис человека. Эпидерма состоит из организованных базальных остистых и зернистых слоев и многослойного рогового слоя. Последний содержит межклеточные липидные слои lam Miller, расположенные в узорах, аналогичных тем, которые обнаруживаются in vivo.

Эти ткани культивируют в среде, не содержащей сыворотки крови. Каждая ткань выращивается в отдельной клеточной культуре. Доступны и другие конфигурации, в том числе формат с высокой пропускной способностью 96 скважин.

Производство ткани занимает примерно три недели, в определенный момент этого процесса ткань поднимается на границу раздела воздушной жидкости, и вся жидкость удаляется с поверхности ткани APIC. Ткани N подаются только через базолатеральную поверхность, которая остается в контакте с запатентованной питательной средой mat tech. Типичный набор Epiderm содержит 24 ткани каждой тканью, девять миллиметров в диаметре во вкладыше для культуры тканей, а также достаточное количество тестовой среды для проведения этого теста на раздражение кожи.

24 вкладыша прочно закреплены на среднем инфузионном розовом геле AGA по одной ткани в каждой лунке стандартного 24-луночного планшета, который перевозится на ночь при температуре от трех до четырех градусов по Цельсию перед началом тестирования химических веществ. Используя тест-систему EPIDERM, подготовьте и простерилизуйте все инструменты и инструменты, используемые в анализе, как описано в письменном протоколе. Часть материалов, таких как ватные палочки, должна поставляться в стерильной упаковке или быть автоклавной.

Для стерилизации таких инструментов, как щипцы, следует использовать 70% этанол, а для стерилизации бутылочек для мытья следует использовать ультрафиолетовое или гамма-излучение. В анализе должны использоваться два критических раствора: предварительно приготовленный DPBS и 5%-ный раствор SDS. В дистиллированной воде в анализе будет использовано примерно два литра стерильного DPBS pH 7, а один набор содержит 24 ткани эпидермиса.

Стерильный DPBS служит как отрицательный контроль, так и моющий раствор. Следует приготовить 5% SDS и использовать его в качестве положительного контроля. Анализ на раздражение кожи начинается после получения набора EPIDERM EPI 200 SIT.

Обязательно проверьте все компоненты комплекта на целостность и немедленно свяжитесь с корпорацией Mat Tech с любыми проблемами, если все есть, перейдите к следующему шагу. Чтобы начать тест, дайте пробирной среде, входящей в комплект, нагреться до комнатной температуры. Не нагревайте предварительно в вытяжке с ламинарным потоком.

Приготовьте один стерильный шестилуночный планшет для каждых трех вставок в эпидермальную ткань и пипеткой введите 0,9 миллилитра исследуемой среды в каждую лунку в стерильных условиях. Откройте пластиковый пакет, удерживающий 24-луночную пластину, содержащую ткани эпидермиса, под стерильным потоком воздуха. Снимите стерильную марлю и с помощью стерильных щипцов аккуратно выньте каждый вкладыш, содержащий эпидермальную ткань.

Удалите остатки, прилипшие к внешним сторонам вкладыша, аккуратно промокнув на стерильной марле или фильтровальной бумаге. А затем поместите салфетки в пустую стерильную 24-луночную пластину в течение следующих пяти минут. Визуально осмотрите вкладыши.

Фиксируйте любые дефекты тканей и избыток влаги на поверхности. Не используйте дефектные ткани или салфетки. Полностью покрывается жидкостью.

Оптимальные тканевые вставки. Должен иметь сухую поверхность и не иметь отслоений, неровностей или избытка жидкости на поверхности. Далее с помощью стерильного ватного тампона тщательно просушите поверхность тканей.

Старайтесь не прикасаться к ткани напрямую. Капиллярные эффекты достаточны для удаления влаги с поверхности после высыхания поверхности. Перенесите три салфетки в верхний ряд из каждых шести.

Луночный планшет предварительно заполнен 0,9 миллилитром пробирной среды. Освободите все пузырьки воздуха, застрявшие под вставками. Затем поместите шесть луночных планшетов, содержащих вкладыши, в инкубатор на один час.

Предварительная инкубация при 37 градусах Цельсия. В конце первого прединкубационного периода перенесите вкладыши из верхних лунок в нижние лунки шестилуночной пластины. Поместите тарелки обратно в инкубатор для ночной предварительной инкубации.

Оставшуюся пробирную среду поместите в холодильник. После ночной предварительной инкубации испытуемые химикаты могут быть нанесены на вставки из тканей эпидермиса. Перед началом химического анализа воздействия поместите все необходимые приборы, растворы и испытуемые химические вещества при комнатной температуре.

В стерильном колпаке протрите все флаконы с нестерильным материалом с 70% этанолом, прежде чем поместить их внутрь колпака. Отрицательный контроль, стерильный DPBS положительный контроль и 5% SDS, а также дистиллированную воду следует поместить в вытяжку и комнатную температуру. Большой флакон следует отложить для отходов.

Приготовьте одну шестерку. Луночный планшет по каждому химикату путем заполнения верхнего ряда только 0,9 миллилитрами пробирной среды на лунку. Пометьте каждую пластину номером салфетки и названием химического вещества.

Примерно за пять минут до планируемого воздействия химических веществ. Извлеките из инкубатора шесть луночных планшетов, содержащих предварительно подготовленные ткани. Затем визуально оцените поверхность тканей.

Удалите влагу с помощью стерильных ватных насадок и не давите на поверхность ткани. Наконец, пометьте крышки шестилуночных планшетов кодами или названиями исследуемых материалов. Не тестируйте более шести химических веществ, включая отрицательные и положительные контрольные вещества в трех экземплярах за один испытательный прогон.

Используйте интервал между нанесением химикатов и промывкой в одну минуту для работы с известными исследуемыми веществами. Следуйте инструкциям, приведенным в паспорте безопасности материала или MSDS для кодированных или неизвестных образцов. Соблюдайте правила химической безопасности и используйте вентилируемый шкаф.

Надевайте перчатки и защищайте глаза и лицо от дозированных тканей химическими веществами с интервалом в одну минуту, чтобы облегчить смывание исследуемых химических веществ после воздействия, держите пластины с дозированными тканями в ламинарном капюшоне до тех пор, пока не будет введена последняя салфетка. На протяжении всей процедуры для манипуляций с тканями и тестирования соединений будет использоваться груша, находящаяся рядом с пипеткой. Пламя горелки Бунзена может быть использовано для создания наконечника в форме колбы для испытания жидких химических веществ.

Нанесите 30 микролитров жидкого испытуемого изделия непосредственно на ткань и немедленно запустите таймер, чтобы он начал отсчет. Поместите капроновую сетку на поверхность ткани Когда таймер достигнет одной минуты, добавьте второй жидкий состав. Используйте три ткани для каждого испытуемого химического вещества, не забывая добавлять каждое соединение с интервалом в одну минуту.

Для тестирования полутвердых веществ используйте пипетку положительного вытеснения, чтобы дозировать 30 микролитров непосредственно поверх ткани. При необходимости разложите химикат пастбищной пипеткой, чтобы он соответствовал размеру ткани. Незадолго до нанесения твердого вещества смочите поверхность ткани 25 микролитрами стерильного DPBS для улучшения контакта поверхности ткани с испытуемым химическим веществом заполните острую ложку весом 25 миллиграмм с тонко измельченным испытуемым материалом.

Нанесите твердое исследуемое химическое вещество на поверхность ткани. При необходимости используйте стерильную грушу, направленную мимо пипетки, чтобы полностью опорожнить ложку. Осторожно встряхните вставки, чтобы улучшить растекание твердого тела по поверхности.

Вы также можете использовать колбу, находящуюся рядом с пипеткой, чтобы она соответствовала размеру ткани. Не надавливайте на поверхность ткани. Наконец, нанесите DPBS в качестве отрицательного контроля и 5% SDS в качестве положительного контроля на тканевые вставки также в трех экземплярах после дозирования последней ткани, перенесите все планшеты на 35 плюс-минус одну минуту в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.

Во время этой инкубации убедитесь, что все материалы, необходимые для этапов стирки, помещены в капюшон. После 35-минутной инкубации извлеките все планшеты из инкубатора. Поместите их в стерильный капюшон и подождите в течение 60 минут, пока не завершится химическое воздействие на ткани первой дозы.

Далее приступаем к процедуре стирки. Прополощите салфетки стерильным ДПБС 15 раз. Чтобы удалить остатки исследуемого материала, заполните тканевый вкладыш постоянным потоком DPBS, подаваемым на расстоянии 1,5 см от поверхности ткани, и опорожните его.

Убедитесь, что струя DPBS не слишком слабая, иначе исследуемое вещество не будет удалено. Не забывайте соблюдать интервал времени в одну минуту для стирки четырех салфеток с нейлоновой сеткой, простирайте пять раз и аккуратно снимите сетку заостренными острыми щипцами. Затем продолжайте с оставшимися 10 стирками, после 15-го промывки прополощите с помощью промывочной бутылки, полностью погрузите вкладыш в три раза и 150 миллилитров DPBS и встряхните, чтобы удалить остатки исследуемого материала.

Наконец, промойте салфетку. Введите один раз изнутри и один раз снаружи с помощью стерильного DPBS. Удалите излишки DPBS из ткани, осторожно встряхнув вкладыш и промокнув его на стерильной промокательной бумаге.

Затем перенесите промокающие тканевые вкладыши в новую шестилуночную пластину, предварительно заполненную исследуемой средой. Опять же, помните, что все эти шаги должны быть выполнены с интервалом в одну минуту, чтобы поддерживать время воздействия в 60 минут для каждого воздействия. После того, как последняя салфетка будет прополоспана, тщательно высушите поверхность каждой ткани стерильным ватным тампоном с ватным наконечником.

Если следы химического вещества все еще присутствуют на поверхности, попробуйте удалить их с помощью стерильного ватного тампона. Последний раз инкубируйте ткани в инкубаторе в течение следующих 24 часов. Запишите время начала инкубации в лист документации по методам.

Также запишите все различные области применения в листе документации по методу. Приложение к стандартной операционной процедуре, предоставленной корпорацией Mat Tech, по перемещению пластин в капоте. Перенесите вкладыш в нижнюю часть шестилуночной пластины, предварительно заполненной 0,9 миллилитровым носителем.

Соберите фильтрующий материал из верхнего ряда и отредактируйте трубу в предварительно маркированную 24-луночную пластину, которую затем помещают при температуре минус 20 градусов Цельсия. До проведения анализа анализ цитокинов и/или хемокинов, высвобождаемых в питательных средах, является необязательным этапом. Продолжайте инкубацию еще от 18 до плюс-минус трех часов для пробирной этикетки МТТ 2 24 луночных планшетов с химическими названиями или кодами.

Помните, что МТТ токсична, поэтому обязательно надевайте защитные перчатки. При обращении. Приготовьте раствор МТТ, разморозив концентрат МТТ и разбавив его разбавителем МТТ.

Защищайтесь от света, так как MTT светочувствительна, и используйте в течение двух-трех часов. Так как МТТ со временем разлагается, пипетку по 300 микролитров среды МТТ в каждую лунку 24-луночного планшета. Теперь выньте шесть лунок из инкубатора.

Промокните нижнюю часть вкладышей на промокательной бумаге и переложите их в 24-луночную пластину, предварительно заполненную МТТ. Поместите планшет на 24 лунки в инкубатор и инкубируйте в течение трех часов. Не забывайте записывать время начала инкубации МТТ в МДС Строго придерживайтесь трехчасового времени инкубации, чтобы избежать получения разных показаний МТТ Когда инкубация МТТ завершена, используйте всасывающий насос с ловушкой токсичных отходов, чтобы аккуратно откачать среду МТТ из всех лунок.

Залейте лунки с помощью DPBS и аспирата. Снова повторите это полоскание еще два раза и убедитесь, что салфетки высохли после последней аспирации. После промывки переложите вкладыши на новую 24-луночную пластину, погрузите вкладыши, аккуратно пипетируя два миллилитра экстрактивного раствора в каждую вставку.

Уровень будет подниматься над верхними краями вставки, таким образом полностью покрывая ткани с обеих сторон. Запечатайте 24-луночную пластину с помощью термосваривателя или параформы для подавления экстракции и испарения. Запишите время начала экстракции в листе с документацией по методам и проводите экстракцию в течение не менее двух часов при комнатной температуре с легким встряхиванием на вибростенде для планшетов После завершения периода экстракции проткните вкладыши иглой для инъекций или колбой, находящейся рядом с пипеткой, и дайте экстракту стечь в лунку, из которой был взят вкладыш.

Выбросьте проколотые вставки и пипеткой влейте раствор в лунку вверх и вниз три раза, пока он не станет однородным. Для каждой ткани также можно использовать встряхиватель для тарелок, настроенный на 120 об/мин. Перелейте две 200 микролитровые аликвоты синей формы и раствора в 96-луночную пластину для микротитрования с плоским дном.

Перенесите дубликаты в соответствии с фиксированной конструкцией пластины, приведенной в прилагаемой таблице к этому видеопротоколу для заготовок. Используйте пропанол ISO, считайте оптическую плотность или OD и используйте 96-луночный спектрофотометр с длиной волны 570 нанометров без использования эталонного фильтра. Введите результаты в таблицу для автоматического расчета результатов.

С учетом поправок, связанных с интерференцией испытательного химического вещества, как указано в сопроводительном протоколе, испытуемое химическое вещество помечено как раздражающее. Если процент жизнеспособности тканей равен или меньше 50% после спектрофотометрического анализа, то OD 570 тканей NC больше или равен единице и меньше или равен 2,5. При этом средняя жизнеспособность тканей ЛК, выраженная в процентах от тканей отрицательного контроля, составляет менее 20%, а SD, рассчитанная на основе индивидуального процента вариабельности тканей трех идентично обработанных репликантов, составляет менее 18%. Соединения, дающие значения жизнеспособности клеток менее 50%, можно считать раздражителями.

Мы только что показали вам, как провести валидированный тест на раздражение кожи в течение 60 минут 42 часа с реконструированной моделью человеческой кожи. Эпидерм. При выполнении этой процедуры важно помнить, что большая часть исследования проводится в стерильных или септических условиях. Если у вас есть необходимость в модификации метода или если вам нужно лучшее объяснение любого из этапов процедуры, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам за помощью и советом.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.