In Vitro Раздражение кожи испытаний (ГСИ), используя эпидермиса реконструкции человеческого эпидермального (RHE) Модель

Epiderm представляет собой реконструированную in vitro модель эпидермиса человека, созданную на основе нормальных человеческих клеток компанией Matt Tech Corporation. Протокол теста на раздражение кожи Epiderm, валидированный EC VM, заменяет традиционные испытания на животных таких продуктов, как косметические средства, сырье и промышленные агенты, которые будут контактировать с кожей человека. Испытание начинается в нулевой день, когда набор для тестирования на раздражение кожи и ткань Epiderm поступают в лабораторию, после чего следует предварительная подготовка в assay medium при инкубации в течение ночи.

В первый день атипичную поверхность эпидермальной ткани в течение одного часа подвергают воздействию предполагаемого раздражающего соединения, после чего во второй день раздражитель удаляют путем промывки. После 24-часовой инкубации культуральный вкладыш переносят в свежую среду, а старую среду используют для анализа высвобожденных цитокинов и хемокинов. Ткань обрабатывают соединением, известным как MTT, которое под действием митохондриальной редуктазы превращается в темно-фиолетовый формазан.

Определение показателей жизнеспособности клеток. Отсутствие темно-фиолетовой окраски образца указывает на снижение жизнеспособности. Если колориметрический показатель исследуемого соединения составляет менее 50% от показателей отрицательного контроля, данное соединение может быть классифицировано как раздражитель.

Здравствуйте, я Елена Кава из компании Matt Corporation. Сегодня мы продемонстрируем процедуру тестирования раздражающего действия на кожу in vitro с использованием реконструированной модели человеческой кожи epiderm. В зависимости от нормативных требований данная процедура может быть использована в качестве полной или частичной замены теста на быстрое раздражающее действие на кожу in vivo.

Эту новую процедуру in vitro можно использовать для идентификации опасностей и маркировки химических веществ и косметического сырья. Итак, приступим. Epiderm получен из культуры эпидермальных кератиноцитов человека для создания трехмерной многослойной и высокодифференцированной модели человеческого эпидермиса.

Ткани митотически и метаболически активны, структурно и биохимически точно имитируют свои аналоги in vivo и обладают гарантируемой воспроизводимостью, как в случае с эпидермисом человека. Epiderm состоит из организованных базального, шиповатого и зернистого слоев, а также многослойного рогового слоя. Последний содержит межклеточные липидные слои Miller, расположенные по схемам, аналогичным тем, что наблюдаются in vivo.

Данные ткани культивируют в безсывороточной среде. Каждую ткань выращивают в отдельном вкладыше для культура клеток. Доступны другие конфигурации, включая 96-луночный формат для высокопроизводительного анализа.

Производство тканей занимает примерно три недели; на определенном этапе этого процесса ткани поднимают до границы раздела фаз «воздух-жидкость» и удаляют всю жидкость с апикальной поверхности ткани. Питание тканей осуществляется только через базалатеральную поверхность, которая остается в контакте с запатентованной культуральной средой компании MatTec. Типичный набор Epiderm содержит 24 образца тканей, каждый из которых имеет диаметр 9 мм и помещен в индивидуальный вкладыш для культивирования тканей, а также достаточное количество assay medium для проведения данного теста на раздражение кожи.

24 вставки плотно закреплены на среде AGA rose gel с наполнителем, по одной ткани в каждой лунке стандартного 24-луночного планшета; транспортировка осуществляется курьерской службой экспресс-доставкой при температуре от 3 до 4 °C перед началом тестирования химических веществ. Используя систему тестирования EPIDERM, подготовьте и стерилизуйте все инструменты и оборудование, используемые в анализе, согласно письменному протоколу. Часть материалов, таких как ватные тампоны, должны поставляться в стерильной упаковке или быть автоклавированы.

Для стерилизации инструментов, таких как пинцеты, следует использовать 70% ethanol, а для стерилизации промывочных флаконов — УФ- или гамма-облучение. Двумя критически важными растворами, используемыми в анализе, являются предварительно приготовленные DPBS и 5% SDS раствор. В дистиллированной воде будет использовано примерно два литра стерильного DPBS pH 7 для анализа с одним набором, содержащим 24 образца тканей эпидермиса.

Стерильный DPBS служит в качестве отрицательного контроля, а также в качестве промывочного раствора. 5% SDS следует приготовить и использовать в качестве положительного контроля. Тест на раздражающее действие на кожу начинается сразу после получения набора EPIDERM EPI 200 SIT.

Убедитесь в целостности всех компонентов набора; при возникновении каких-либо вопросов немедленно свяжитесь с корпорацией Mat Tech. Если все компоненты в наличии, переходите к следующему шагу. Для начала анализа доведите supplied с набором среду до комнатной температуры. Не прогревайте её заранее в ламинарном шкафу.

Подготовьте одну стерильную 6-луночную планшетку на каждые три вставки с тканью эпидермиса и в стерильных условиях внесите по 0,9 мл assay medium в каждую лунку. В условиях стерильного воздушного потока откройте пластиковый пакет с 24-луночной планшеткой, содержащей ткани эпидермиса. Снимите стерильную марлю и с помощью стерильного пинцета осторожно извлеките каждую вставку с тканью эпидермиса.

Остатки агароза, прилипшие к внешним сторонам вставки, аккуратно удалите, промакивая их стерильной марлей или фильтровальной бумагой. Затем в течение последующих пяти минут поместите ткани в пустой стерильный 24-луночный планшет. Визуально осмотрите вставки.

Зафиксируйте любые дефекты ткани и избыток влаги на поверхности. Не используйте ткани с дефектами или ткани, полностью покрытые жидкостью.

Оптимальные тканевые вставки. Поверхность должна быть сухой, без отслоений, неровностей или избытка жидкости. Затем, используя стерильный ватный тампон, осторожно просушите поверхность тканей.

Старайтесь не касаться ткани напрямую. Капиллярного эффекта достаточно для удаления влаги с поверхности после ее высушивания. Перенесите три образца ткани в верхний ряд из каждых шести.

Планшет с лунками, предварительно заполненный 0,9 мл assay medium. Удалите все пузырьки воздуха, скопившиеся под вставками. Затем поместите шесть планшетов с вставками в инкубатор на один час.

Предварительная инкубация при 37 °C. По окончании первого периода предварительной инкубации перенесите вкладыши из верхних лунок в нижние лунки планшета на шесть лунок. Поместите планшеты обратно в инкубатор для предварительной инкубации в течение ночи.

Поместите оставшуюся часть среды для анализа в холодильник. После предварительной инкубации в течение ночи к вставкам с тканью эпидермиса можно приступать к нанесению исследуемых химических веществ. Перед началом анализа воздействия химических веществ доведите все необходимые устройства, растворы и исследуемые вещества до комнатной температуры.

В стерильном боксе протрите все флаконы с нестерильными материалами 70% ethanol перед их помещением внутрь бокса. Стерильный DPBS для отрицательного контроля, положительный контроль, 5% SDS и дистиллированная вода также должны быть помещены в бокс при комнатной температуре. Отдельно следует подготовить большую пробирку для отходов.

Подготовьте по одному шестилуночному планшету для каждого химического вещества, заполнив только верхний ряд средой для анализа объемом 0.9 milliliters на лунку. Маркируйте каждый планшет, указав номер ткани и название химического вещества.

Примерно за пять минут до запланированного воздействия химических веществ извлеките из инкубатора шестилуночные планшеты с предварительно подготовленными тканями. Затем проведите визуальную оценку поверхности тканей.

Удалите остатки влаги с помощью стерильных ватных тампонов, не оказывая давления на поверхность ткани. В завершение подпишите крышки планшета на шесть лунок кодами или названиями тестируемых материалов. В одном цикле тестирования проверяйте не более шести химических веществ, включая отрицательный и положительный контроли, каждое в трех повторностях.

При работе с известными исследуемыми веществами используйте интервал нанесения химического реагента и последующей промывки в одну минуту. Для кодированных или неизвестных образцов руководствуйтесь инструкциями, приведенными в паспорте безопасности вещества (MSDS). Соблюдайте правила химической безопасности и работайте в вытяжном шкафу.

Наденьте перчатки, используйте средства защиты глаз и лица. Обрабатывайте ткани химическими веществами с интервалом в одну минуту, чтобы облегчить промывание тестовых химических веществ после воздействия; держите планшеты с обрабатываемыми тканями в ламинарном шкафу до момента обработки последнего образца ткани. На протяжении всей процедуры для манипуляций с тканями и тестируемыми соединениями будет использоваться пипетка с закругленным концом. Для создания закругленного наконечника при работе с жидкими тестовыми химическими веществами можно использовать пламя горелки Бунзена.

Нанесите 30 µL жидкого исследуемого вещества непосредственно на ткань и немедленно запустите таймер в режиме отсчета времени вперед. Поместите нейлоновую сетку на поверхность ткани. Когда таймер достигнет одной минуты, добавьте второе жидкое соединение. Используйте три образца ткани для каждого исследуемого химического вещества, добавляя каждое соединение с интервалом в одну минуту.

Для тестирования полутвердых веществ используйте поршневой дозатор с положительным вытеснением, чтобы нанести 30 µL непосредственно на ткань. При необходимости распределите химическое вещество пастуралевской пипеткой так, чтобы площадь нанесения соответствовала размеру ткани. Незадолго до нанесения твердого вещества увлажните поверхность ткани 25 µL стерильного DPBS для улучшения контакта поверхности ткани с исследуемым химическим веществом; наполните специальную ложечку для нанесения 25 mg мелкоизмельченного тестового материала.

Нанесите твердое тестовое химическое вещество на поверхность ткани. При необходимости используйте стерильную пипетку с грушей, чтобы полностью опорожнить ложку. Осторожно встряхните вставки, чтобы улучшить распределение твердого вещества по поверхности.

Вы также можете использовать наконечник с закругленным концом вашего дозатора, чтобы подобрать размер под образец ткани. Не оказывайте давления на поверхность ткани. В завершение, в качестве отрицательного контроля нанесите DPBS, а в качестве положительного — 5% SDS на вставки с тканями, также в трех повторностях; после дозирования последней ткани перенесите все планшеты на 35 ± 1 минуту в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C.

Во время инкубации убедитесь, что все материалы, необходимые для этапов промывки, находятся в вытяжном шкафу. По истечении 35 минут инкубации извлеките все планшеты из инкубатора. Поместите их в стерильный вытяжной шкаф и дождитесь завершения 60-минутного периода химического воздействия для тканей первой дозы.

Затем приступите к процедуре промывки. Промойте ткани стерильным DPBS 15 раз. Чтобы удалить остатки исследуемого материала, заполните вставку с тканью, подавая DPBS непрерывной струей на расстоянии 1,5 сантиметров от поверхности ткани, после чего опорожните ее.

Убедитесь, что поток DPBS достаточно сильный, иначе исследуемое вещество не будет удалено. Помните о необходимости соблюдения одноминутного интервала при промывании четырех тканей через нейлоновую сетку (повторить пять раз); аккуратно снимите сетку с помощью остроконечного пинцета. Затем выполните остальные 10 промываний; после 15-го раза полностью погрузите вставку в промывочную бутыль с 150 milliliters DPBS трижды и встряхните, чтобы удалить остатки исследуемого материала.

Наконец, промойте ткань. Промойте один раз изнутри и один раз снаружи стерильным DPBS. Удалите излишки DPBS с ткани, осторожно встряхнув вставку и промокнув ее стерильной фильтровальной бумагой.

Затем перенесите пропитанные вкладыши с тканью в новый шестилуночный планшет, предварительно заполненный assay medium. Опять же, помните, что все эти действия должны быть выполнены в течение одной минуты, чтобы сохранить время экспозиции 60 минут для каждого образца. После промывки последнего образца ткани осторожно просушите поверхность каждой ткани стерильным ватным тампоном.

Если на поверхности всё еще присутствуют следы химического вещества, попробуйте удалить их с помощью стерильного ватного тампона. В завершение поместите ткани в инкубатор на следующие 24 часа. Запишите время начала инкубации в лист документации по методам.

Также занесите все варианты применения в лист документации метода. Приложение к стандартной операционной процедуре, предоставленной Mat Tech Corporation, по перемещению планшетов в вытяжном шкафу. Перенесите вставку в нижнюю часть шестилуночного планшета, предварительно заполненного 0.9 milliliter среды.

Соберите среду из верхнего ряда и перенесите ее в предварительно промаркированный 24-луночный планшет, который затем поместите при температуре -20 °C. Анализ цитокинов и/или хемокинов, высвобожденных в культуральную среду, является необязательным этапом до проведения основного анализа. Продолжите инкубацию еще в течение 18 ± 3 часов; для МТТ-анализа промаркируйте две 24-луночные планшеты химическими названиями или кодами.

Помните, что MTT токсичен, поэтому при работе с ним обязательно используйте защитные перчатки. Приготовьте раствор MTT, разморозив концентрат MTT и разбавив его разбавителем MTT.

Берегите раствор от света, так как MTT светочувствителен, и используйте его в течение двух-трех часов. Поскольку MTT со временем разлагается, перенесите по 300 µL среды с MTT в каждую лунку планшета на 24 лунки. Теперь извлеките планшеты на 6 лунок из инкубатора.

Промокните дно вкладышей фильтровальной бумагой и перенесите их в 24-луночный планшет, предварительно заполненный MTT. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор и инкубируйте в течение трех часов. Не забудьте зафиксировать время начала инкубации с MTT в MDS; строго соблюдайте трехчасовой интервал инкубации, чтобы избежать расхождения в показаниях MTT. По завершении инкубации с MTT осторожно аспирируйте среду с MTT из всех лунок с помощью вакуумного насоса с ловушкой для токсичных отходов.

Снова заполните лунки DPBS и аспирируйте раствор. Повторите данное промывание еще дважды, убедившись, что после последнего аспирирования ткани сухие. После промывок перенесите вкладыши в новый 24-луночный планшет и погрузите их, осторожно внеся по 2 mL экстрагирующего раствора в каждый вкладыш.

Уровень жидкости поднимется выше верхних краев вставки, полностью покрывая ткани с обеих сторон. Герметизируйте планшет на 24 лунки с помощью термозапаивателя или парафильма, чтобы предотвратить утечку экстракта и испарение. Зафиксируйте время начала экстракции в листе документации по методам; экстракцию следует проводить в течение не менее двух часов при комнатной температуре при осторожном встряхивании на шейкере для планшетов. По завершении периода экстракции проколите вставки инъекционной иглой или наконечником пипетки с закругленным концом, чтобы экстракт стек в лунку, из которой была извлечена вставка.

Утилизируйте проколотые вставки и трижды перемешайте раствор в лунке с помощью пипетки до достижения гомогенности. Для каждого образца ткани также можно использовать шейкер для планшетов, установленный на 120 RPMs. Перенесите две аликвоты по 200 µL синей формы и раствора в 96-луночный микротитрационный планшет с плоским дном.

Перенесите дубликаты в соответствии со схемой расположения планшета, указанной в таблице к данному видеопротоколу, для холостых проб. Используйте изопропанол, измерьте оптическую плотность (OD) с помощью спектрофотометра для 96-луночных планшетов при длине волны 570 нм без использования референсного фильтра. Внесите результаты в таблицу для автоматического расчета данных.

Учитывайте поправки на химическое вмешательство исследуемого вещества, как указано в прилагаемом протоколе; исследуемое химическое вещество помечается как раздражитель, если процент жизнеспособности тканей по результатам спектрофотометрического анализа составляет 50% или менее, при этом значение OD₅₇₀ тканей NC составляет от 1 до 2,5 включительно, средняя жизнеспособность тканей PC, выраженная в процентах от тканей отрицательного контроля, составляет менее 20%, а SD, рассчитанное на основе индивидуальных показателей процентной жизнеспособности тканей трех идентично обработанных повторностей, составляет менее 18%. Соединения, при которых значения жизнеспособности клеток составляют менее 50%, могут считаться раздражителями.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить валидированный тест на раздражение кожи через 60 минут и 42 часа с использованием реконструированной модели человеческой кожи Epiderm. При выполнении данной процедуры важно помнить, что большая часть теста проводится в стерильных или асептических условиях. Если возникнет необходимость в модификации метода или вам потребуется более подробное объяснение любого из этапов процедуры, пожалуйста, обращайтесь к нам за помощью и советом.

На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.