Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Протокол флуоресцентной гибридизации in situ в ядрах сперматозоидов человека широко внедрен в практику клинической диагностики. Одним из применений данной методики является скрининг плоидности сперматозоидов. В рамках консультирования по вопросам репродукции мужчин с бесплодием отмечается, что частота числовых аномалий у таких пациентов выше, чем в общей популяции, и они часто демонстрируют отклонения в параметрах спермы.

Это представляет собой повышенный риск передачи данных аномалий потомству. Сегодня мы продемонстрируем протокол флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в деконденсированных ядрах сперматозоидов для анализа хромосом 13, 18, 21, X и Y. После сбора образца его следует оставить при комнатной температуре на 20 минут до полного разжижения. Для начала выполнения протокола образец необходимо перенести в центрифужную пробирку.

Растворы, которые будут использоваться в первой части эксперимента, — гипертонический раствор, предварительно нагретый до 37 °C, и смесь метанола с уксусной кислотой в соотношении три к одному. Эти растворы должны быть свежеприготовленными. Затем образец центрифугируют при 1000 ×g в течение пяти минут.

Теперь осторожно удалите супернатант и по каплям добавляйте гипертонический раствор, пока объем не достигнет примерно 10 milliliters. Пробирку необходимо выдержать при температуре 37 °C в течение 30 минут, после чего образец следует снова центрифугировать. Центрифугирование приводит к осаждению сперматозоидов на дно пробирки, что позволяет заменить гипотонический раствор метанолом.

Центрифугирование в уксусной кислоте необходимо повторять, заменяя метанол-уксусную смесь столько раз, сколько потребуется для получения белого осадка. При достижении этого результата следует добавить больше метанол-уксусной смеси. Конечный объем необходимо отрегулировать в соответствии с той степенью дисперсии клеток, которую вы хотите получить в дальнейшем.

Заключительным этапом является подготовка мазков путем нанесения фиксированного образца на предметные стекла Рида, хранящиеся в метаноле при температуре -20 °C. Для последующей локализации полезно отметить область стекла, содержащую мазок спермы. Это можно легко сделать с помощью алмазного карандаша на обратной стороне стекла. После подтверждения оптимальной дисперсии клеток стекла следует хранить при температуре -20 °C в течение не менее 24 часов.

Перед тем как приступить к протоколу. В этой части эксперимента будут использоваться раствор цитрата натрия, серия этанола, DRE, фатал и фиде. После размораживания предметных стекол фиксированные образцы необходимо промыть и дегидратировать, погрузив их в две последовательные Коплановские банки с 2×SSC.

Для каждого этапа обработки в копланах потребуется три минуты. Затем предметные стекла необходимо погружать на две минуты в каждую из банок с этанолом в порядке возрастания концентрации. После этого, чтобы перейти к следующим этапам, предметные стекла следует высушить.

Поскольку ДНК в ядре сперматозоида сильно конденсирована, перед ее денатурацией необходимо деконденсировать хроматин. Это можно сделать с помощью раствора DTT при 37 °C. Данный реагент действует путем разрыва дисульфидных мостиков протаминов, которые обеспечивают спирализацию ДНК в ядре сперматозоида. Время инкубации предметного стекла в DTT должно быть скорректировано в зависимости от реактивности образца семени к данному препарату.

Обычно это занимает около восьми минут, хотя время может варьироваться от двух до 15 минут. По истечении этого времени препараты необходимо немедленно перенести в 2×SSC на три минуты, затем снова на три минуты, после чего выдержать по две минуты в каждой из банок с этанолом Coplan. Для гибридизации зондов крайне важно работать с одноцепочечной ДНК. Это требует этапа денатурации перед добавлением зондов, который включает инкубацию в течение пяти минут в растворе Formamide при 73 °C. Для завершения обработки препаратов требуется финальный перенос в раствор этанола с погружением предметных стекол на одну минуту в каждую банку Coplan.

Затем препараты готовы к гибридизации в рамках исследований методом FISH, проводимых для клинической диагностики. Чаще всего анализируют половые хромосомы, а также хромосомы 13, 18 и 21. Для анализа этих хромосом мы будем использовать набор многоцветных ДНК-зондов от компании Vysis.

Сюда входит один флакон с комбинацией зондов для альфа-сателлитного региона хромосом X, Y и 18, меченных зеленым и аквамариновым цветом соответственно, и другой флакон с комбинацией зондов для хромосом 13 и 21, меченных зеленым и оранжевым цветом соответственно. Объем добавляемой смеси зондов будет варьироваться в зависимости от размера области, которую вы хотите гибридизировать; для покровного стекла размером 15 на 15 достаточно пяти микролитров.

Обе смеси зондов предварительно денатурированы в гибридизационном буфере для удобства использования, поэтому их можно добавлять непосредственно на деcondensed- и денатурированные слайды. Для этих экспериментов также доступны другие коммерческие зонды для широкого спектра хромосом и локусов. Однако, как правило, такие зонды требуют предварительной денатурирующей обработки перед добавлением смеси к целевому образцу.

В таких ситуациях достаточно следовать инструкциям производителя. Целевую область необходимо накрыть покровным стеклом и загерметизировать каучуковым цементом. После этого стекла готовы к помещению в гибридизационную камеру, предварительно нагретую до 37 °C, где их следует инкубировать при данной температуре от 6 до 24 часов.

В заключительной части протокола мы будем использовать два промывочных раствора, приготовленных из растворов цитрата натрия разной концентрации и детергента NP 40. По истечении времени инкубации предметные стекла можно извлечь из гибридизационной камеры, чтобы удалить резиновый цемент. Затем осторожно снимите покровное стекло.

Как показано, предметные стекла погружают на две минуты в первый промывочный раствор, предварительно нагретый до 73 °C. Затем их переносят во второй промывочный раствор при комнатной температуре еще на одну минуту. Эти две промывки помогут нам устранить любые неспецифические сигналы гибридизации. После этих двух промывок необходимо дождаться высыхания стекол, чтобы завершить последний этап протокола.

На данном этапе добавляют краситель для контрастирования, чтобы облегчить визуализацию ядер клеток. Одним из наиболее часто используемых для этой цели препаратов является dpi. Объем добавляемого реагента должен быть согласован с размером гибридизированной области; для покровного стекла размером 18 на 18 в качестве ориентира используется соответствующий объем.

Достаточно использовать 8 µL DPI. Смековую пластинку можно запечатать лаком для ногтей, после чего препараты будут готовы к визуализации. В противном случае их можно хранить при температуре -20 °C до проведения анализа.

Для визуализации мы будем использовать эпифлуоресцентный микроскоп Olympus BX 60, оснащенный трехполосным фильтром для dpi, Texas Red, FITC, а также однополосными фильтрами для aqua, FITC и Texas Red. Через трехполосный фильтр в препарате, гибридизованном с x, Y и 18, отображаются сигналы для этих трех хромосом. Используя однополосный фильтр для aqua, мы можем визуализировать только флуоресцентные сигналы для хромосомы 18. В каждом нормальном сперматозоиде должен присутствовать один такой сигнал.

Однако при использовании однополосного фильтра только для FITC некоторые сперматозоиды демонстрируют флуоресцентный зеленый сигнал, соответствующий X-хромосоме. Сперматозоиды, лишенные зеленого сигнала, должны проявлять красный сигнал Y-хромосомы, который можно специфически визуализировать с помощью фильтра для Texas red. При визуализации гибридизации 1321 через трехполосный фильтр мы можем различить сигналы этих двух хромосом.

Зеленый сигнал соответствует хромосоме 13 и может быть специфически визуализирован с помощью узкополосного фильтра для FITC. Узкополосный фильтр для Texas Red позволяет специфически визуализировать сигналы для хромосомы 21. Все нормальные сперматозоиды должны иметь по одному сигналу для каждого из этих двух зондов.

Таким образом, ниже приведены основные этапы протокола. Повторим, что процесс фиксации следует проводить тщательно, добавляя методическую уксусную кислоту по каплям, чтобы получить качественные растяжки. Чтобы избежать образования агрегатов сперматозоидов в процессе деконденсации, время инкубации в растворе DTT необходимо корректировать в зависимости от реактивности образца семени к данному реагенту.

Чрезмерное воздействие DTT на сперматозооиды приведет к рассеиванию сигналов в конце протокола, тогда как недостаточное воздействие приведет к отсутствию гибридизации зонда и потере некоторых сигналов. В то время как денатурация образца спермы является обязательной, денатурация зонда должна проводиться в соответствии с указаниями производителя. Важно строго контролировать время и температуру двух промывок после гибридизации.

Слишком высокая температура или чрезмерное время промывки могут привести к исчезновению некоторых сигналов, в то время как противоположные условия не позволят устранить неспецифические сигналы. Наконец, для качественной визуализации и интерпретации сигналов крайне важно использование эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного соответствующими специфическими фильтрами. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.