Моделирование мышей колит использованием декстрана сульфата натрия (DSS)

Мышам дают 3% DSS при либидо в течение четырех дней. В то время как регистрируется вес и наличие диареи и каловой крови, ежедневный СТШ заменяется водой из автоклава после четвертого дня. После трех дней пребывания в воде мышей усыпляют и удаляют толстые кишки.

Толстые кишки измеряются и взвешиваются. Затем из колоний формируют швейцарские булочки или сосиски и исследуют под микроскопом. В этой видеостатье будет продемонстрирован забор и обработка толстой кишки при мурн-модели колита.

Эта процедура используется для изучения колита в лаборатории доктора Кристофера Уильямса из Департамента биологии рака Университета Вандербильта перед началом лечения декстрином сульфатом натрия. Исходные весовые коэффициенты получаются на протяжении всего эксперимента. Ежедневный вес берут после взвешивания мышей, делают 3% веса на объем, раствор декстрина сульфата натриевой соли или DSS в воде.

Чтобы эта модель была эффективной, DSS должен иметь низкую молекулярную массу, чтобы раствор DSS был достаточен для наполнения бутылки водой для каждой клетки мышей и фильтровал раствор с помощью фильтра из ацетата целлюлозы 0,45 микрометра. Замените бутылку с питьевой водой в клетке для мышей на бутылку с 3% раствором DSS. Если в вашем учреждении используется автоматизированная система полива, разместите запретительные наконечники на водосточных трубах, чтобы у мышей не было доступа к какому-либо другому источнику воды.

Через четыре дня мышей снова взвешивают, чтобы количественно оценить системные последствия колита. Потеря веса является обычным явлением при тяжелой травме, однако может не проявляться еще несколько дней в тот же день. На четвертый день замените раствор DSS водой еще на три дня, чтобы обеспечить некоторое восстановление эпителия толстой кишки.

Три дня спустя, на седьмой день, мышей снова взвешивают. Затем толстая кишка может быть собрана у усыпленных мышей, как показано в следующем разделе. Чтобы извлечь толстую кишку, обнажите вентральную сторону усыпленной мыши, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к брюшной полости.

Полностью смочите брюшную полость с 70% этанолом. Обхватите среднюю линию живота тканевыми щипцами и поднимите вверх. Таким образом, наклеиваем тент на кожу с помощью ножниц с тонким наконечником.

Разрежьте брюшную полость, чтобы обнажить содержимое брюшной полости. Разрез следует расширить до кончика мечевидного отростка по средней линии, а затем расширить вдоль нижней части реберных краев в двустороннем направлении. Определите тонкую кишку, слепую кишку и толстую кишку.

Тщательно рассекайте косую кишку, дразните толстую кишку от окружающей брыжейки. После этого пересектите толстую кишку, углубите малый таз до свободного места. Дистальный отдел ободочной кишки от прямой кишки.

Следует следить за тем, чтобы не были перерезаны артерии или вены. Кроме того, имейте в виду, что толстая кишка может легко порваться. Поэтому аккуратно удалите толстую кишку из брыжейки.

Пересеките ободочную кишку по краю сиквела Colona, чтобы освободить проксимальный отдел ободочной кишки. Удалите толстую кишку и полностью с помощью питательной иглы 20 калибра и шприца объемом 10 миллилитров, интубируйте и промойте толстую кишку ледяным PBS до тех пор, пока ЭИТ полностью не очистится от стула. Важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки, держа дистальный конец толстой кишки ближайшим к вам.

Начните с измерения длины толстой кишки с помощью цифрового штангенциркуля. Длина толстой кишки – еще один показатель тяжести травмы. Колит увеличивает отек и укорачивает общую длину толстой кишки.

На этом этапе собранные толстые кишки могут быть либо обработаны как сосиски для макроскопического анализа, либо превращены в швейцарский рулет для гистологического анализа острого колита. Мы продемонстрируем эти методы в следующих разделах для обработки толстой кишки как колбасы Для макроскопического анализа всей толстой кишки важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки. Поэтому держите дистальный конец толстой кишки ближайшим к вам.

Отрежьте два куска нерассасывающегося шва, один примерно один дюйм в длину, а другой два дюйма в длину. Используйте двухдюймовый кусок шва, чтобы перевязать дистальный конец толстой кишки как можно ближе к краю, сохраняя при этом хорошее уплотнение. Затем поместите подающую иглу 20 калибра, содержащую пять миллилитров 10% буферизованного формалинфосфата, в проксимальный конец толстой кишки.

Неплотно завяжите оставшийся кусок шва непосредственно проксимальнее луковицы подающей иглы. Теперь крепко возьмитесь за толстую кишку у колбы иглы для кормления и введите достаточное количество формалина, обеспечивающего расширение толстой кишки. Затяните узел в шве при извлечении подающей иглы, таким образом оставив введенную расширенную толстую кишку.

В качестве колбасы заполните коническую тубу объемом 15 миллилитров 10% буферизованным, формальным и фосфатом и пометьте тубу. Поместите толстую кишку в трубку и зафиксируйте на 24 часа. Через 24 часа слейте формин в соответствующий контейнер для отходов и замените его 70% этанолом еще на 24 часа.

Толстые кишки могут храниться в 70% этаноле неограниченное время при комнатной температуре. Когда вы будете готовы к анализу толстой кишки, извлеките ее из конической трубки. Обрежьте струны с каждого конца скальпелем, стараясь не повредить толстую кишку.

Помните, что дистальный конец имеет самый длинный кусок веревки. Разрежьте толстую кишку продольно от дистального к проксимальному концу так, чтобы она образовала длинный лист. Теперь толстую кишку можно рассмотреть под рассекающим микроскопом.

Разрежьте двоеточие в продольном направлении и разложите двоеточие как плоский лист. Для перекатывания толстой кишки требуются две пары щипцов и техника двумя руками. Захватите щипцами оба боковых края дистального края ободочной кишки, продолжайте последовательно сворачивать толстую кишку, вращая и отпуская щипцы, двигаясь к проксимальному краю, тем самым создавая спираль с третьим измерением или швейцарский валик.

Если двоеточие прилипает к бумаге Ватмана, смочите бумагу и двоеточие небольшим количеством PBS для поддержания формы. Крепко возьмитесь за рулон щипцами и пересеките иглой 27 с половиной калибра. Закрепите рулон, согнув иглу при выходе из рулона.

Теперь поместите рулон в промаркированную тканевую кассету и поместите кассету в банку с 10% буферизованным формалинфосфатом. Оставьте его при комнатной температуре на 24 часа, чтобы закрепить ткань. Через 24 часа слейте формалин и замените его на 70% этанол еще на четыре часа.

Толстые кишки могут храниться в 70% этаноле неограниченное время при комнатной температуре. Эта модель позволяет исследователю получать, фиксировать и анализировать толстую кишку, тем самым позволяя анализировать тяжесть колита. Для макроскопического анализа всей толстой кишки толстая кишка может быть обработана как колбаса, которая пропитана формалином и полностью расширена.

Открытая колбаса должна лежать ровно. Если колбасный метод был выполнен правильно, неподвижная толстая кишка будет расширена, и вся поверхность слизистой можно будет легко манипулировать и рассматривать под рассекающим микроскопом. Для гистологического анализа толстая кишка может быть обработана как швейцарский рулон.

Рулон фиксируется иглой и помещается в тканевую кассету для фиксации. Когда рулон разрезан и установлен, он должен образовывать репрезентативный срез всей толстой кишки, если его правильно прокатать, участки швейцарского рулона могут быть окрашены гематином и ASIN, чтобы определить степень повреждения толстой кишки. Помните, что дистальный конец толстой кишки находится в центре рулона на горке.

В этом примере воспаление и повреждение крипты очевидны в толстой кишке, обработанной DSS, по сравнению с контрольной группой, обработанной водой. Мы только что показали вам, как собирать и обрабатывать толстую кишку из мышиной модели острого колита. При выполнении этой процедуры важно, чтобы вы были хорошо организованы, прежде чем жертвовать.

У мышей, например, есть все пробирки и кассеты, помеченные для каждой мыши, а также все доступные инструменты и реагенты. Кроме того, ведите подробный учет веса мыши и длины толстой кишки. Наконец, убедитесь, что вы выделили достаточно времени на обработку.

Обычно это занимает 15 минут на одну мышь для новичка и от шести до восьми минут для более опытного в этой технике.