Моделирование мышей колит использованием декстрана сульфата натрия (DSS)

Мышам в течение четырех дней дают 3% DSS ad libitum. Ежедневно регистрируют массу тела, наличие диареи и крови в кале; после четвертого дня DSS заменяют автоклавированной водой. Через три дня пребывания на воде мышей усыпляют и извлекают их толстые кишки.

Обдольники измеряют и взвешивают. Затем их сворачивают в виде рулета («швейцарского рулета») или цилиндра («колбаски») и исследуют под микроскопом. В данной видеостатье будет продемонстрирован процесс сбора и подготовки образцов толстой кишки на мышиной модели колита.

Данная процедура используется для изучения колита в лаборатории доктора Кристофера Уильямса на кафедре биологии рака Университета Вандербильта перед началом введения декстрансульфата натрия. Исходная масса тела фиксируется на протяжении всего эксперимента. Ежедневное взвешивание мышей проводится после приготовления 3% (масса/объем) водного раствора соли декстрансульфата натрия (DSS).

Для эффективности данной модели необходимо использовать DSS с низким молекулярным весом. Приготовьте достаточный объем раствора DSS, чтобы заполнить одну поилку для каждой клетки с мышами, и профильтруйте раствор через целлюлозно-ацетатный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Замените бутылку с питьевой водой в клетке мышей на бутылку с 3% раствором DSS. Если в вашем учреждении используется автоматическая система подачи воды, установите заглушки на носики поилок, чтобы исключить доступ мышей к любым другим источникам воды.

Через четыре дня мыши взвешиваются повторно для количественной оценки системных последствий колита. Потеря веса характерна при тяжелом повреждении, однако она может стать заметной только через несколько дней. В четвертый день раствор DSS заменяют водой на следующие три дня, чтобы обеспечить частичное восстановление эпителия толстой кишки.

Спустя три дня, на седьмой день, мыши снова взвешиваются. Затем из эвтаназированных мышей можно извлечь толстую кишку, как показано в следующем разделе. Для извлечения толстой кишки положите эвтаназированную мышь вентральной стороной вверх, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к брюшной полости.

Полностью смочите область живота 70% ethanol. Захватите ткани по срединной линии живота пинцетом и приподнимите их, создавая натяжение кожи, после чего сделайте надрез тонкими ножницами.

Произведите разрез брюшной стенки, чтобы обнажить органы брюшной полости. Продолжите разрез по средней линии до кончика мечевидного отростка, а затем вдоль нижнего края ребер с обеих сторон. Определите местоположение слепой кишки и ободочной кишки.

Осторожно выделите обводящую кишку из окружающего ее брыжеечного эпиплоона. После этого пересеките обводящую кишку глубоко в области таза, чтобы освободить дистальный отдел обводящей кишки от прямой кишки.

Следует соблюдать осторожность, чтобы не перерезать артерии или вены. Также имейте в виду, что толстая кишка может легко порваться, поэтому аккуратно отделите толстую кишку от брыжейки.

Пересеките ободочную кишку по краю Colona sequel, чтобы освободить проксимальный отдел ободочной кишки. Удалите ободочную кишку; используя иглу для кормления 20G и шприц объемом 10 мл, проведите интубацию и промывание ободочной кишки ледяным PBS до полного удаления каловых масс из EIT. Важно сохранять правильную ориентацию ободочной кишки, располагая ее дистальный конец ближе к себе.

Начните с измерения длины ободочной кишки с помощью цифрового штангенциркуля. Длина ободочной кишки является еще одним показателем степени тяжести повреждения. Колит усиливает отек и приводит к укорочению общей длины ободочной кишки.

На данном этапе собранные толстые кишки можно либо обработать в виде «колбасок» для макроскопического анализа, либо изготовить «швейцарский рулет» для гистологического анализа острого колита. В следующих разделах мы продемонстрируем эти методы. При подготовке толстой кишки в виде «колбаски» для макроскопического анализа всего органа важно соблюдать правильную ориентацию; поэтому расположите дистальный конец толстой кишки ближе к себе.

Отрежьте два фрагмента нерассасывающегося шовного материала: один длиной примерно один дюйм, другой — два дюйма. Используйте двухдюймовый фрагмент нити, чтобы перевязать дистальный конец ободочной кишки как можно ближе к краю, обеспечивая при этом надежную герметизацию. Затем введите в проксимальный конец ободочной кишки кормовую иглу 20-го калибра, содержащую пять миллилитров 10% буферизированного формалин-фосфатного раствора.

Слабо завяжите оставшийся конец шовного материала непосредственно проксимальнее луковицы питающей иглы. Теперь крепко зажмите ободочную кишку в области луковицы питающей иглы и введите достаточное количество формалина, чтобы кишка расправилась. Затяните узел на шве при извлечении питающей иглы, оставив ободочную кишку в наполненном расправленном состоянии.

Наполните коническую пробирку объемом 15 миллилитров 10% буферным формальдегид-фосфатным раствором и промаркируйте пробирку. Поместите в пробирку ободочную кишку и фиксируйте в течение 24 часов. Через 24 часа слейте формалин в соответствующий контейнер для отходов и замените его 70% этанолом еще на 24 часа.

Ободочную кишку можно хранить в 70% этаноле неограниченное время при комнатной температуре. Перед началом анализа извлеките ободочную кишку из конической пробирки. Аккуратно перережьте нити на обоих концах скальпелем, стараясь не повредить ткань кишки.

Помните, что на дистальном конце находится самый длинный отрезок нити. Разрежьте ободочную кишку вдоль от дистального к проксимальному концу, чтобы она имела вид длинного листа. Теперь ободочную кишку можно рассмотреть под диссекционном микроскопе.

Разрежьте ободочную кишку вдоль и разложите ее плоским слоем. Для сворачивания кишки потребуются два пары пинцетов и техника работы обеими руками. Захватите пинцетами оба латеральных края дистального отдела ободочной кишки, затем последовательно сворачивайте кишку, поочередно вращая и отпуская пинцеты в направлении к проксимальному краю, создавая таким образом трехмерную спираль (так называемый «швейцарский рулет»).

Если ободочная кишка прилипла к бумаге Whatman, смочите бумагу и кишку небольшим количеством PBS, чтобы сохранить форму. Плотно зафиксируйте свернутую кишку пинцетом и пересеките ее иглой калибра 27,5 G. Закрепите сверток, согнув иглу при ее выходе из ткани.

Теперь поместите свернутый образец в маркированную кассету для тканей, а затем поместите кассету в емкость с 10% фосфатно-буферизированным формалином. Оставьте при комнатной температуре на 24 часа для фиксации ткани. По истечении 24 часов слейте формалин и замените его 70% этанолом еще на четыре часа.

Обдольники можно бессрочно хранить в 70% ethanol при комнатной температуре. Данная модель позволяет исследователю извлекать, фиксировать и анализировать толстую кишку, что дает возможность оценить степень тяжести колита. Для макроскопического анализа всей толстой кишки ее можно обработать по методу «колбасы», пропитав формалином и полностью расправив.

Раскрытую кишку следует разложить на плоскости. При правильном выполнении метода «сосиски» фиксированная ободочная кишка будет расширена, что позволит легко манипулировать всей поверхностью слизистой оболочки и осматривать ее под диссекционным микроскопом. Для гистологического анализа ободочную кишку можно подготовить методом «швейцарского рулета».

Свернутый образец закрепляют иглой и помещают в кассету для тканей для фиксации. При правильном сворачивании после разрезания и монтажа на предметное стекло должен получиться репрезентативный срез всей толстой кишки; срезы «швейцарского рулета» можно окрашивать гематином и ASIN для определения степени повреждения толстой кишки. Следует помнить, что дистальный конец толстой кишки находится в центре рулета на предметном стекле.

В данном примере в толстой кишке, обработанной DSS, заметно воспаление и повреждение крипт по сравнению с контрольной группой, получавшей воду. Мы только что продемонстрировали вам способ извлечения и обработки толстой кишки из мышиной модели острого колита. При выполнении данной процедуры важно тщательно подготовиться и организовать рабочий процесс до момента забива животных.

Например, для каждой мыши должны быть подготовлены промаркированные пробирки и кассеты, а все инструменты и реагенты должны быть под рукой. Кроме того, необходимо вести подробный учет массы тела мышей и длины ободочной кишки. Наконец, убедитесь, что вы выделили достаточное количество времени на проведение процедур.

Обычно процедура занимает 15 минут на одну мышь для новичка и от шести до восьми минут для специалиста, владеющего данной техникой.