Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Общая цель данного протокола заключается в определении оптимальных условий электропорации для трансфекции первичных клеточных линий, таких как эмбриональные фибробласты мыши (mfs). В качестве примера, клетки MF и выбранная нуклеиновая кислота вносятся в 96-луночный планшет для электропорации, подключенный к системе Gene Pulser MX, что позволяет протестировать несколько условий электропорации за один цикл. Для экспериментов по оптимизации клетки культивируют после электропорации и анализируют на предмет эффективности трансфекции.

С помощью эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии можно выбрать наиболее эффективные условия электропорации для последующей трансфекции. Здравствуйте, я Адам Маккой, старший научный сотрудник отдела экспрессии генов в BioRad Laboratories. Сегодня мы продемонстрируем процедуру простого подбора оптимальных условий электропорации для трансфекции первичных клеточных линий.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения экспрессии генов в этих клетках. Сегодня я буду использовать три разные культуры эмбриональных фибробластов мыши (MEF) с разным числом пассажей. Я использую культуры с разным числом пассажей по двум причинам.

Во-первых, я продемонстрирую, насколько важно состояние клеток: при работе с первичными клеточными линиями даже несколько дополнительных дней культивирования могут повлиять на эффективность трансфекции. Во-вторых, я хочу показать, что процесс подбора оптимальных условий остается неизменным, даже если эффективность трансфекции снижается по мере старения клеток. В вашем эксперименте, скорее всего, не потребуется использовать клетки разного возраста.

Вы можете следовать этой же процедуре, используя собственный план эксперимента. Если вы хотите сравнить экспрессию генов в контрольных клетках и клетках, подвергнутых воздействию, вы можете сначала определить оптимальные условия, а затем провести эксперимент, используя установленные параметры. Также возможен вариант одновременного проведения оптимизации и основного эксперимента.

Как я продемонстрирую сегодня, я буду использовать плазмиду, кодирующую GFP, для оценки эффективности трансфекции с помощью проточной цитометрии. Однако процедура электропорации останется прежней, даже если вы выполняете другие задачи, например, введение siRNA и анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени. Итак, приступим.

Эмбриональные фибробласты мыши (MEFs), используемые в данном протоколе, являются адгезивными клетками. Поэтому первым этапом работы с этими клетками является их открепление от дна флакона с использованием стандартных протоколов культивирования тканей, включающих трипсинизацию. После того как клетки открепятся от флакона, нейтрализуйте трипсин средой, содержащей сыворотку, и соберите клетки в конические пробирки объемом 50 мл.

После сбора центрифугируйте клетки до образования осадка. Их следует промыть, ресуспендировав в известном объеме PBS. После полного ресуспендирования подсчитайте количество клеток, учитывая, что для экспериментов по электропорации потребуется концентрация 1 миллион клеток на миллилитр.

Рассчитайте необходимое количество клеток на основе данных подсчета и перенесите их в чистую пробирку. Центрифугируйте образец для осаждения клеток. Затем осторожно удалите супернатант.

Ресуспендируйте клетки в буфере для электропорации до концентрации 1 миллион клеток на миллилитр и добавьте плазмиду в концентрации 20 микрограмм на миллилитр. Пластины разделены на 96 лунок, где столбцы обозначены цифрами от 1 до 12, а строки — буквами от A до H. Каждая группа из четырех лунок, или набор лунок, имеет общую пару электродных пластин, поэтому клетки в этих лунках подвергаются одному и тому же импульсу. Например, клетки в лунках 1A, 1B, 1C и 1D электрически соединены в одном наборе лунок и получат одинаковый импульс.

Следующая группа из четырех лунок — 2A, 2B, 2C и 2D — получит второй импульс при запуске протокола. Несмотря на то, что параметры могут быть идентичными, 96-луночный планшет для электропорации настроен таким образом, что верхняя и нижняя половины планшета разделены. Таким образом, лунки 1E, 1F, 1G и 1H в нижней части планшета получили один импульс, который отличается от импульса, полученного лунками 1A, 1B, 1C и 1D в верхней части.

В данном эксперименте будет использована только половина планшета. Первые три лунки в каждом наборе лунок содержат клетки разного возраста. Клетки в верхнем ряду (ряд A) прошли пять пассажей.

Клетки в ряду B прошли девять пассажей, а клетки в ряду C — 13 пассажей. В ряду D до проведения электропорации находится только буфер для электропорации. Рекомендуется проверить протокол, чтобы убедиться в правильности настроек.

Данный протокол предполагает подачу шести импульсов с экспоненциальным затуханием, за которыми следуют шесть прямоугольных импульсов. Напряжение импульсов с экспоненциальным затуханием увеличивается с 200 вольт до 450 вольт, при этом во всех случаях используется емкость всего 350 микрофарад. Это обусловлено низким сопротивлением используемого буфера для электропорации или генного импульса.

Прямоугольные импульсы варьируются как по напряжению, так и по длительности. Настройку емкости прибора необходимо согласовать с проводимостью смеси для электропорации. При использовании буфера с более высоким сопротивлением, такого как DMEM, можно использовать тот же диапазон напряжений, но с более высокой емкостью, например 950 µF для импульсов с экспоненциальным спадом.

Если оптимальная емкость используемого вами буфера неизвестна, вам также потребуется варьировать емкость в условиях электропорации, которые вы тестируете. Следующим шагом является внесение 150 µL смеси клеток и плазмид в каждую лунку, используемую в данном эксперименте. Четвертая лунка в каждом используемом наборе лунок заполняется буфером для электропорации.

После загрузки планшета поместите его в камеру для планшетов MXL и закройте крышку. Затем нажмите кнопку pulse для электропорации клеток. Аппарат последовательно подает электрические импульсы в каждую лунку в соответствии с условиями, указанными в выбранном протоколе.

Электропорация всех клеток занимает несколько секунд. После завершения импульса извлеките планшет из камеры для планшета. Перенесите клетки из каждой лунки в чашку для культивирования с предварительно подогретой культуральной средой.

Данные клетки выращивают в среде DMEM с добавлением 10% FBS; контрольные образцы, не подвергавшиеся электропорации, берут из оставшейся смеси клеток и плазмид и переносят в чашки с культурой, содержащие предварительно прогретую среду того же состава, что и среда, использованная для электропорированных клеток. В завершение осторожно перемешивают круговыми движениями.

Затем осторожно постучите по планшету, чтобы равномерно распределить клетки, после чего поместите его в инкубатор на 24 часа при 37 °C и 5% carbon dioxide для последующего анализа эффективности трансфекции и определения оптимальных условий электропорации для вашего эксперимента. После подбора оптимальных параметров электропорации для последующих экспериментов можно выбрать один из двух методов. Исследователь может либо продолжить электропорировать клетки в 96-луночных планшетах, либо электропорировать клетки в кюветах по одному образцу за раз.

Кюветы позволяют анализировать только один образец за раз и требуют в четыре раза большего объема, чем одна лунка 96-луночного планшета, однако отдельные кюветы дешевле и удобнее в использовании, когда требуется обработать небольшое количество образцов. Система Gene Pulse или MX Cell сконструирована таким образом, что в планшетах и кюветах можно использовать одни и те же настройки электропорации. Вместо камеры для планшета используйте шоковый блок MXL для кювет.

Отсоедините камеру для планшета от задней части прибора и подключите модуль подачи импульса (shock pod). Поскольку модуль подачи импульса обеспечивает только импульс, запрограммированный для лунок A, B, C, D 1, может потребоваться выбор другой программы. Чтобы выбрать ранее сохраненную программу, нажмите кнопку «Home» (Главная).

Затем выберите вариант три — пользовательские протоколы (user protocols). Если вы уже находитесь в нужной пользовательской папке, нажмите enter, чтобы выбрать пользовательские протоколы, и прокрутите список вниз. Чтобы выделить нужную программу, нажмите enter для её выбора.

Прибор готов к работе. После выбора программы подготовьте кюветы. Смесь плазмиды и ЭМФ готовится так же, как было показано ранее.

Заполните каждую лунку диаметром 0,4 см тем же объемом, который использовался для всего набора лунок в 96-луночных планшетах. Поскольку набор состоит из четырех лунок и на каждую лунку было израсходовано 150 microliters буфера или клеточной смеси, на каждую лунку диаметром 0,4 см следует нанести 600 microliters плазмидной клеточной смеси.

Затем поместите кювету в камеру шокового модуля и нажмите кнопку pulse, чтобы подать электрический разряд на клетки. После электропорации действуйте так же, как при методе с использованием планшета: перемешайте клетки, затем перенесите аликвоты в лунки культуральных планшетов, заполненных предварительно нагретой средой; установите контрольную группу. Для лунок, в которых электропорация не проводилась, аккуратно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями и слегка постучите по нему.

Затем оставьте клетки для восстановления на 24 часа при 37 °C и 5% carbon dioxide перед анализом эффективности трансфекции после проведения процедуры и периода восстановления клеток. Проанализируйте эффективность трансфекции качественно с помощью эпифлуоресцентной микроскопии и количественно с помощью проточной цитометрии; клетки, которые были успешно электропорированы и теперь экспрессируют ген GFP, выглядят зелеными при эпифлуоресцентной микроскопии — здесь представлен типичный успешный результат. Наблюдение за клетками в фазовом контрасте позволяет визуализировать как трансфецированные, так и нетрансфецированные клетки.

Здесь представлены клетки, подвергнутые электропорационному импульсу с наименьшим напряжением 200 вольт. Клетки в значительной степени сливны из-за высокой плотности клеточной культуры. То же самое поле зрения при эпифлуоресценции показывает, что ряд клеток экспрессируют маркер GFP, однако их доля составляет лишь небольшой процент от количества клеток, видимых на предыдущем изображении при 250 вольтах.

Общее количество живых клеток, наблюдаемых при фазово-контрастной микроскопии, немного снижается при эпифлуоресценции. Можно заметить, что число клеток, экспрессирующих GFP, увеличилось при максимальном приложенном напряжении 375 вольт. Хотя количество видимых живых клеток уменьшилось, значительный процент оставшихся клеток экспрессируют GFP.

Выбор оптимальных условий зависит от дизайна эксперимента. В некоторых случаях оптимальным будет наибольшее количество трансфицированных клеток, в то время как в других — максимально возможный процент трансфекции.

Нас интересует процент GFP-положительных клеток при каждом условии и то, как этот процент меняется в зависимости от возраста клеток. Цитофлуориметрия позволяет получить количественную информацию о результатах трансфекции при различных условиях электропорации. Здесь представлен процент GFP-положительных клеток в данном пассаже.

Пять клеток. При каждом из 12 условий электропорации максимальный процент трансфекции составил примерно 80% при самом высоком напряжении с экспоненциальным спадом. Условие импульса шесть и 70 при самом сильном протестированном квадратном импульсе (условие 12), при котором клетки подвергались пассированию девять раз перед электропорацией.

Общая тенденция процента трансфекции почти идентична, однако наблюдается очень незначительное снижение показателей. Ниже приведены проценты GFP-положительных клеток в клетках 13-го пассажа, которые демонстрируют заметное снижение процента трансфекции по сравнению с более молодыми клетками. Максимальные показатели трансфекции оказались примерно в два раза ниже тех, что были достигнуты с молодыми клетками, что подтверждает важность использования здоровых клеток как можно скорее после выделения.

Я только что продемонстрировал вам, как использовать систему электропорации MXL для определения оптимальных условий электропорации макрофагов или других первичных клеточных линий. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать жизнеспособные клетки максимально короткое время после изоляции, а также применять параметры электропорации, соответствующие используемому буферу для электропорации. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.