Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Дрозофилы гемоциты расходиться по совокупности развивающегося эмбриона. Этот протокол демонстрирует, как монтировать и изображение этих миграций использованием эмбрионов с флуоресцентно меченных гемоциты.

В этом видео показана процедура монтирования эмбрионов дрозофилы для визуализации гемоцитов. Их эмбриональные макрофаги. Зародыши укладывают мухами на пластины агарового яблочного сока в клетку для несушки на ночь.

На следующий день сельскохозяйственная пластина удаляется, и эмбрионы промываются с сельскохозяйственной пластины на клеточное ситечко после дополнительной промывки для удаления мусора. Клеточный фильтр, содержащий эмбрионы, погружают в отбеливатель, чтобы покрыть эмбрионы. После смывания отбеливателя зародыши переносят в каплю воды.

Затем капля воды отсасывается, и эмбрионы покрываются углеродным маслом. Эмбрионы с соответствующими стадиями и видимыми he цитами переносятся на мембрану Петри между двумя прикрепленными покровными стеклами и тщательно выравниваются в масле. Затем на эмбрионы надевается третья защитная пластинка и приклеивается лаком для ногтей.

Подвижность гемоцитов внутри эмбриона теперь может быть визуализирована через самую верхнюю покровную пластину на микроскопе. Здравствуйте, меня зовут Дженнифер Заед из лаборатории Брайана Стрма в отделе аренды в Сеуле и молекулярной биофизики в Королевском колледже Лондона. Я Ян Эванс из лаборатории Вуда на факультете биологии и биохимии Университета Бата.

Сегодня мы покажем вам процедуру крепления Josephs bryo к живому образу, гемосайт, эмбриональные макрофаги этого организма. Мы используем эту процедуру для изучения реакции развития, рассеивания и ветра на эти важные иммунные клетки и цитоскелетные механизмы, которые они используют для осуществления этих процессов. Итак, приступим.

Начните эту процедуру с получения соответствующих линий TRO, OAL, содержащих гемоциты, специфичные для гало четырех драйверов и генетически кодируемые флуоресцентные репортеры под контролем БАС. Здесь змеиная девушка четыре используется для управления экспрессией флуоресцентного красного ядерного маркера от беспилотного летательного аппарата Red Stinger. Для обсуждения ряда рекомендуемых четырех драйверов GAL и конструкций БАС, пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом размещения 20 дрозофил каждого пола в клетке для несушек.

Клетка для несушек состоит из 55-миллилитровой сельскохозяйственной пластины для яблочного сока, установленной на дне пластиковой трубки с марлей, закрывающей другой конец для обеспечения потока воздуха. В качестве альтернативы можно использовать простой пластиковый пикер с отверстиями. Продырявив основание, дайте мухам акклиматизироваться к клетке для кладки в течение как минимум двух дней после того, как мухи акклиматизируются, пересядьте на новую предварительно теплую решетку для яблочного сока и дайте мухам отложить на ночь при температуре 25 градусов Цельсия.

Для получения информации о сборе эмбрионов с более скрытой стадией, пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом. После того, как мухи высидят в течение соответствующего времени для кладки, используйте бутылку для мытья, чтобы нанести примерно три миллилитра воды на тарелку. Затем с помощью кисти с мягким кончиком извлеките эмбрионы из яблочного сока, вытесненные эмбрионы можно легко увидеть невооруженным глазом, держа клеточное ситечко над стаканом.

Вылейте воду из яблочного сока в клеточное ситечко для сбора зародышей. Затем добавьте в яблочный сок еще воды. Аате. Повторяйте процесс процеживания до тех пор, пока не будет собрано нужное количество эмбрионов.

Далее, с помощью промывочной бутылки, промойте эмбрионы в клеточном ситечке, используя примерно 10 миллилитров воды. После того, как эмбрионы будут промыты, поместите клеточное ситечко в крышку от яблочного сока Aerate. Добавьте чистый отбеливатель ровно настолько, чтобы засусывать эмбрионы в клеточном ситечке, чтобы покрыть эмбрионы.

Перенесите сетчатый фильтр для клеток и крышку чашки Петри в микроскоп для вскрытия, чтобы следить за украшением эмбрионов. При светлопольном освещении украшение завершено, когда дорсальные придатки растворятся, что должно произойти в течение двух минут. После того, как украшение будет завершено, извлеките из отбеливателя сетчатый фильтр, содержащий эмбрионы, снова держа его над стаканом.

Используйте бутылку для мытья, чтобы аккуратно, но тщательно смыть остатки отбеливателя. Нанесите лабораторные салфетки синего цвета на нижнюю сторону клеточного фильтра, чтобы смыть остатки воды. Если синий цвет меняется на белый или присутствует розовый остаточный отбеливатель, продолжайте стирку, убедившись, что все следы отбеливателя были удалены, прежде чем переходить к следующему этапу.

Удаление лишней воды из клеточного фильтра облегчает сбор эмбрионов с помощью кисти на следующем этапе. После того, как весь отбеливатель будет удален из эмбрионов, поместите каплю воды в крышку чашки Петри с помощью тонкой кисточки. Соберите все покрытые оболочкой эмбрионы из ситечка и снова суспендируйте их в капле.

Затем нанесите химическую салфетку на внешнюю сторону клеточного фильтра, чтобы высушить эмбрионы. Как только эмбрионы высохнут, добавьте каплю гало-углеродного масла, 700, чтобы покрыть все эмбрионы. Затем нанесите вторую небольшую каплю масла рядом с каплей, содержащей эмбрионы.

Осмотрите эмбрионы под флуоресцентным диссекционным микроскопом. Определите эмбрионы желаемого генотипа с соответствующей стадией для визуализации латеральной миграции цитов. По вентральной средней линии.

Выбирайте эмбрионы с 13 по 14 стадию. В этом примере циты идентифицируются флуоресцентными ядрами и видны в голове и вдоль вентрального нервного канатика и развивающегося дорсального сосуда для визуализации подвижности гемо после диспергирования по эмбриону, выберите эмбрионы стадии 15. На этом этапе гемос уже рассеется по всему эмбриону.

Тем не менее, три параллельные линии гемо должны быть видны на вентральной стороне эмбриона после боковой миграции от средней линии. После того, как эмбрионы будут выбраны, используйте пару изогнутых щипцов для часов номер пять, чтобы зачерпнуть выбранные эмбрионы. Соблюдайте осторожность, чтобы не проколоть мембраны флакона.

Затем поместите эмбрионы во вторую каплю масла на нижнюю сторону 50-миллиметровой чашки Petri perm lumax. Поместите две небольшие капли масла Halo Caron 700 на расстоянии примерно одного сантиметра друг от друга. Приложите защитный лист к каждой капле под светлым светом на диссекционном микроскопе.

Осторожно перенесите до 15 эмбрионов с помощью изогнутых щипцов. Выравниваем зародыши вентральной стороной вверх и параллельно краю покрова. Скользит после того, как зародыши выровняются по небольшой капле масла и дайте ему растечься, чтобы образовать однородный слой между двумя покровными стеклами.

После того, как масло растекается, это может занять несколько минут. Убедитесь, что эмбрионы все еще вентральны. Стороной вверх, если эмбрионы слегка перевернулись.

Снова переместите их с помощью щипцов. Наконец, с помощью пинцета номер три. Накройте эмбрионы третьей крышкой.

Соединение двух ранее приклеенных покровных листков. Приклейте этот чехол листом к чехлу. Скольжение поддерживает с помощью лака для ногтей.

Теперь эмбрионы готовы к визуализации. Этот эмбрион Red Stinger был установлен вентральной стороной вверх, а покадровые изображения были получены на флуоресцентном микроскопе Leica M 2 0 5. Циты визуализируются по их красным меченым ядрам

Фильм начинается на стадии с 12 по 13 стадию развития, когда циты покидают головку и мигрируют вниз по вентральной средней линии. Примерно через час клетки начинают мигрировать от средней линии, чтобы рассеяться в боковые положения вдоль вентральной поверхности. На оставшуюся часть разработки.

Гемоциты очень активны, мигрируют по всему эмбриону. Мы должны показать вам, как следить за эмбрионом Иосифа, чтобы следить за движением или за стороной гемо жить in vivo. При выполнении этой процедуры важно обращаться с эмбрионами осторожно, особенно на чашке для петрохимической завивки, чтобы не повредить их, поскольку эмбрионы находятся в масле, они относительно устойчивы к обезвоживанию, но следует соблюдать осторожность, чтобы не обесцвечивать эмбрионы слишком долго при удалении кориона.

Наконец, установив несколько эмбрионов, вы дадите себе наилучшие шансы получить эмбрион в идеальной ориентации для визуализации в реальном времени. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.