Улучшенный метод выделения РНК из Лоблолли Пайн ( П. taeda L.) и других хвойных пород

Данный материал был подготовлен исследователями из Университета Джорджии и Школы лесного хозяйства и природных ресурсов Уорнелла. В этом демонстрационном видео описывается процесс забора тканей ксилемы и флоэмы с последующим выделением РНК из Pinus taeda, известной как сосна болотная — важнейшего вида хвойных деревьев для производства лесопродукции в Соединенных Штатах. После сруба дерева (в данном случае 40-летнего экземпляра) основной ствол разрезается на чурбаки длиной примерно 50 см.

Затем болт в нескольких местах делают продольные надрезы бензопилой, чтобы облегчить снятие коры. С помощью молотка и стамески кору приподнимают до тех пор, пока её не станет возможно отделять секциями. Далее флоэмную ткань удаляют вручную, счищая её с внутренней стороны секций коры, и немедленно погружают в жидкий азот.

После удаления коры тонкий слой вторичной ксилемы можно собрать, соскоблив поверхность заготовки односторонним лезвием бритвы. Водянистую ткань ксилемы немедленно помещают в жидкий азот. При данном сборе мы также отобрали образцы реактивной древесины, обычно называемой древесиной сжатия и противоположной древесиной, перед тем как отрезать ветви от основного ствола.

Сначала ориентация ветви отмечается краской из распылителя, чтобы определить области, содержащие два типа ткани: растягивающую древесину в верхней части ветви и сжимающую древесину в нижней. При снятии коры ветви сначала надрезаются бензопилой по линиям, разграничивающим сжимающую и растягивающую древесину; затем удаление коры выполняется так же, как и при подготовке цилиндров из основного ствола, с тем исключением, что кора удаляется только в области, соответствующей конкретному типу реакции.

Заготавливаемая древесина удаляется в любое заданное время. Обычно удалять крупные участки коры с таких небольших ветвей сложнее. Образцы реактивной древесины вторичной ксилемы собирают таким же образом, как и обычную вторичную ксилему: путем соскабливания лезвием бритвы с последующим немедленным погружением в жидкий азот.

Обратите внимание на красновато-коричневый цвет, характерный для компрессионной древесины. Стоит отметить, что сбор и обработка нескольких образцов с большого дерева требуют участия нескольких человек, при этом каждый выполняет определенную задачу, чтобы все типы тканей собирались одновременно; это помогает снизить деградацию РНК. Образцы, замороженные в жидком азоте, затем переносятся в маркированные пакеты для хранения и помещаются на сухой лед для транспортировки обратно в лабораторию. Первым шагом является измельчение ткани с использованием криогенной мельницы Specs model 68 50; по сравнению с растиранием в ступке с пестиком, этот этап значительно увеличивает выход РНК при экстракции из образцов древесных тканей, при этом образцы охлаждаются с помощью жидкого азота.

Сначала ткань вручную разламывают на более мелкие фрагменты и помещают в камеру для образца. Камеру вставляют в держатель, фиксируют ее, и образец измельчают в течение двух минут. Конечный продукт имеет консистенцию грубого порошка.

Протокол экстракции РНК занимает два дня. В первый день 2,5 граммов замороженной ткани добавляют в буфер для экстракции РНК, предварительно нагретый до 65 °C. Образец интенсивно встряхивают для перемешивания, затем добавляют равный объем хлороформа и снова перемешивают образец путем осторожного переворачивания пробирки.

Затем образец помещают на вращающееся колесо на пять минут. После этого образец переносят в высокоскоростные тефлоновые пробирки Oakridge и центрифугируют в роторе SS 34 при 12,000 RPM в течение пяти минут. Верхнюю водную фракцию переносят в новую пробирку и добавляют половину объема хлороформа.

Образец перемешивают на вортексе в течение одной минуты, затем снова помещают на роторное колесо на пять минут. После второго центрифугирования водную фракцию снова переносят в полипропиленовую высокоскоростную пробирку объемом 50 мл и центрифугируют при 10, 000 RPM в течение 20 минут. Для удаления остаточных твердых частиц образец переливают в пробирку Falcon объемом 50 мл и добавляют к нему 10 molar хлорид лития в объеме одной четверти от общего объема образца.

Образец перемешивают путем встряхивания и выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи. На второй день образец, в котором осадили хлорид лития, центрифугируют при 11 000 об/мин в течение 30 минут при температуре 4 °C.

Надсадную жидкость сливают и утилизируют, после чего пробирки переворачивают на химические салфетки на одну минуту. Для удаления остатков жидкости осадок РНК, который должен быть виден, ресуспендируют в 800 µL горячего буфера SSTE, предварительно нагретого до 65 °C. Необходимо несколько раз произвести пипетирование вверх-вниз по всему периметру осадка, чтобы обеспечить его полное растворение.

Затем перенесите ресуспендированную РНК в микроцентрифужную пробирку, сертифицированную как свободная от РНКаз (типа Two Mil and Beyond). Нагрейте образец в течение одной-двух минут на водяной бане при 65 °C, после чего подвергните его вортексированию для обеспечения полной ресуспензии образца. При необходимости процедуру можно повторить.

Теперь добавьте равный объем буферизованного фенол-хлороформа. Перемешайте образец на вортексе в течение 15–20 секунд и центрифугируйте в микроцентрифуге при 14 000 об/мин в течение трех минут. Водную фракцию перенесите в новую микропробирку и добавьте равный объем.

Образец перемешивают на вортексе и центрифугируют в микроцентрифуге, как и при предыдущей экстракции. Для заключительного этапа органической экстракции пробирки с разделяющим гелем сначала центрифугируют в микроцентрифуге при 11,000 RPM в течение двух минут.

Затем образец РНК, полученный в результате предыдущей экстракции, добавляют к фазово-блокирующему гелю, после чего добавляют половину объема хлороформа и осторожно перемешивают обе фазы путем пипетирования. Затем образец центрифугируют при 11 000 RPM в течение пяти минут, и водную фазу с РНК переносят в новую микроцентрифужную пробирку Ambion RNA free. Следующим этапом является простое осаждение РНК путем добавления к образцу 1/10 объема 3 M ацетата натрия (pH 4.8) и двух объемов 100% этанола.

Образец перемешивают на вортексе, кратковременно помещают в морозильную камеру при -80 °C на 30 минут, а затем центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 минут при 4 °C. Супернатант осторожно аспирируют, а небольшой белый осадок промывают 1 mL ледяного 70% этанола; после аспирации процедуру промывки этанолом повторяют. Остатки этанола выпаривают, оставив пробирки открытыми на лабораторном столе на пять минут.

Осадки РНК ресуспендируют в 100 µL воды, обработанной DEPC, путем вортексирования и нагревания при 65 °C. При необходимости процедуру можно повторить. Определяют концентрацию образца.

Спектрофотометрически рассчитывают соотношения 260/280 и 260/230 для оценки степени загрязнения образца белками и углеводами. Гель-электрофорез в 1% AGROS геле используется для качественной оценки качества образца, загрязнения геномной ДНК и деградации РНК. Целостность критически важных образцов дополнительно оценивают с помощью биоанализатора Agilent 2100 для определения соотношения рибосомальных 28S/18S и индекса целостности РНК (RIN). Благодарим вас за просмотр нашего видео по сбору образцов тканей и выделению тотальной РНК из LOB (сосны обыкновенной).

Следующие лица отвечают за съемку и производство данного обучающего видео.