Расшифровка аксонального Пути генетически определенные группы нейронов в Чик нервной трубки Используя В ово Электропорация
May 2nd, 2010
В этом видеоролике показано, как визуализировать аксонального пути генетически определенных групп нейронов в эмбриональном куриных спинного мозга использования В ово Электропорации репортер генов под контролем конкретных элементов усилителя.
Здравствуйте, я Хам из лаборатории доктора Ревью Клара на факультете медицинской нейробиологии Еврейского университета в Иерусалиме. Здравствуйте, меня зовут Софи Эсман, и я тоже из лаборатории Ларса. Сегодня мы покажем вам процедуру Инново, электропорацию и открытую книгу спинного мозга.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения аксональных траекторий генетически определенной популяции нейронов в эмбриональном спинном мозге. Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, переложите оплодотворенные яйца белых леггорнов из комнатной температуры во увлажненный инкубатор, желательно с качающимися лотками при температуре от 37 до 38 градусов по Цельсию.
Важно следить за температурой и влажностью инкубатора, чтобы получить жизнеспособные и синхронизированные эмбрионы. Эмбрионы цыплят подвергаются электропоре, когда они достигают стадии гамбургера и Гамильтона или HH от 18 до 20, что является оптимальной стадией для усиления специфической экспрессии зависимости от гамбургера. На этом этапе голова лежит под прямым углом к туловищу.
Также на стадии ГГ с 18 по 20 следует также увидеть обширный набор дополнительных эмбриональных кровеносных сосудов, таких как передние, задние правые и левые сосуды жизненно важных линий. Эмбрионы цыплят достигают стадии HH с 19 по 20 после 66 часов инкубации, и в это время извлекают яйца из инкубатора После извлечения яиц поместите их горизонтально и подождите от пяти до 10 минут. Теперь зародыш находится на верхнем полюсе яйцеклетки.
Перед электроперированием эмбрионы готовят раствор Хэнка со 100 единицами на миллилитр пенициллина и 0,1 мг на миллилитр стрептомицина. Приготовьте желаемую смесь ДНК в концентрации от двух до пяти микрограммов на микролитр и добавьте несколько зерен быстрого зеленого красителя для легкой визуализации введенной ДНК. Также подготовьте пипетку для рта, стерильную иглу для шприца, маленькие ножницы и скотч.
Подготовьте микрокапилляры, вытягивая стеклянные капилляры диаметром 0,5 миллиметра с помощью съемника для пипетки. Поместите вольфрамовые электроды в микроманипуляторы и подключите электроды к генератору импульсов. Установите напряжение на генераторе импульсов на минус 30 вольт, длину каждого импульса на 50 миллисекунд и количество импульсов на три.
Приступайте к электропорации перед экспозицией и обработкой эмбрионов. Вставьте шприц в узкий полюс яйца и удалите пять-шесть миллилитров альбумина из каждого яйца. Альбумин удаляют, чтобы он не высыпался.
При резке на следующем этапе используйте маленькие ножницы для резки. Откройте овальное окно на верхней стороне яйца после раскрытия эмбриона цыпленка, смочите его от 0,5 до одного миллилитра ганкса и раствором пенициллина стрептомицина. Далее с помощью перпета для рта нагрузите микрокапилляр стекла.
При использовании смеси красителей ДНК микрокапилляр правильного диаметра должен легко загружаться ДНК. В бинокулярном положении эмбрион для введения ДНК в нервную трубку. Поместите эмбрион хвостом к себе.
На этой стадии развития спинной мозг хорошо виден и поэтому никаких контрастных методик не требуется. Спинной мозг герметизирован как на голове, так и на хвосте. Однако при микрокапиллярных проколах большее количество отверстий в нервной трубке и проникновение в нее под небольшим углом, микрокапилляр, который достаточно тонкий и правильного диаметра, должен проникать в трубку, не повреждая ее.
Введите ДНК с помощью перпета для рта. Микрокапилляр правильного диаметра должен высвобождать ДНК с регулярным выдохом. Зеленый краситель должен распространяться от кончика хвоста вверх к везикулам развивающегося мозга.
Вводите до тех пор, пока нервная трубка не заполнится ДНК Электропорация необходима для того, чтобы введенная ДНК сначала попала в клетки. Расположите электроды параллельно нервной трубке и как можно ближе к ней, не касаясь самой трубки. Убедитесь, что электроды покрыты жидкостью для обеспечения электропроводности во время импульса.
Обычно достаточно раствора Хэнка, добавленного сразу после воздействия на эмбрион. Но если непосредственно перед импульсом нет ни капли раствора Хэнка с расположенными электродами и погруженными в жидкий импульс для электроактивного действия, то осторожно снимите электроды и заклейте окно и яйцо скотчем. Важно полностью запечатать яйцо, чтобы предотвратить высыхание эмбриона в течение следующего инкубационного периода.
Поместите яйцо обратно в инкубатор и инкубируйте до тех пор, пока эмбрион цыпленка не достигнет эмбрионального развития. День шестой или Е шестой, когда наступает время визуализации, когда эмбрион с электропорацией достиг эмбрионального развития. День шестой, Е шесть через три дня после электропорации извлеките его из яйца и поместите в чашку Петри, покрытую силиконовым покрытием, содержащую PBS, с помощью тонких ножниц.
Отрежьте мембраны и растяните эмбрион на его вентральной стороне с помощью штифтов, вбитых в силикон, чтобы удержать его на месте. С помощью острого вольфрамового микрокапилляра. Сделайте продольный разрез вдоль крышной пластины от заднего мозга вниз к хвосту.
Сделайте два дополнительных продольных разреза с обеих сторон спинного мозга, отделив ганглии дорсальных корешков или DRG от спинного мозга. Отделите напольную пластину от тканей, начиная от хвоста до заднего мозга, оставив спинной мозг нетронутым. Наконец, с помощью тонких ножниц разрежьте спинной мозг в поперечном разрезе у задней части мозга и отделите спинной мозг от тела.
Теперь, когда спинной мозг изолирован, поместите его в новую чашку Петри с силиконовым покрытием, содержащую PBS, используя булавки для удержания его от заднего мозга до хвоста, получив плоское крепление. Зафиксировать спинной мозг в 4% паральдегиде в PBS в течение одного часа при иммуноокрашивании при комнатной температуре после иммуногистохимической процедуры, подробного и сопроводительного письменного протокола для открытого монтажа спинного мозга. Подготовка книги к визуализации.
Нанесите жир или силикон в форме прямоугольника на предметное стекло и капните PBS внутри прямоугольника. С помощью пинцета расположите спинной мозг, растянутый посередине прямоугольника и вытяните жидкость вокруг него. С помощью пасты на каждого питомца нанесите одну-две капли крепежного средства на спинной мозг и накройте крышкой.
Прижмите крышку. Чтобы не было пузырьков воздуха. Держите горки в темноте в четыре градуса Цельсия.
Осмотрите спинной мозг с помощью конфокальной микроскопии. Вот некоторые репрезентативные результаты отторжения аксонов спинномозговых интернейронов цыплят в контрольных экспериментах, где RFP экспрессируется во всех нейронах с использованием вездесущего энхансера из ЦМВ, большинство нейронов и их аксонов помечены. Расшифровать траекторию аксонов субпопуляций нейронов невозможно.
Однако при применении специфических элементов усиления выявляется определенный аксональный путь специфической субпопуляции DI двух нейронов в этом примере. Итак, мы только что показали вам, как электроуправлять щечной нервной трубкой с помощью определенного нейронного усилителя в точке Е три и как подготовить спинной мозг с открытой книгой в точке Е шесть. Когда вы делаете эту процедуру, вы должны помнить о необходимости быть осторожным и терпеливым.
Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах. Удачи.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это видео демонстрирует процедуру визуализации аксональных путей генетически определенных нейронов в эмбриональном спинном мозге курицы с использованием электропорации in ovo. Метод позволяет исследователям эффективно изучать аксональные траектории.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Развивающаяся биология
- Электрофизиология
Фон
- Понимание аксональных путей имеет ключевое значение для нейробиологических исследований.
- Электропорация in ovo – это метод, используемый для введения генных маркеров.
- Эмбриональный спинной мозг курицы служит моделью для изучения развития нейронов.
- Генетически определенные нейрональные популяции могут предоставить представление о специфических нейронных цепях.
Цель исследования
- Визуализация аксональных путей в эмбриональном спинном мозге.
- Использование электропорации in ovo для исследований экспрессии генов.
- Улучшение понимания развития и связей нейронов.
Используемые методы
- Перенос оплодотворенных куриных яиц в инкубатор с увлажненным воздухом.
- Поддержание инкубации при температуре от 37 до 38 градусов Цельсия.
- Выполнение электропорации in ovo для введения генных маркеров.
- Подготовка препаратов открытой книги спинного мозга для визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация аксональных путей в спинном мозге.
- Демонстрация эффективности электропорации in ovo.
- Понимание траекторий генетически определенных нейрональных популяций.
- Разработка надежного метода для изучения развития нейронов.
Выводы
- Метод предоставляет ценный инструмент для нейробиологических исследований.
- Электропорация in ovo эффективна для доставки генов в эмбриональных моделях.
- Понимание аксональных путей может способствовать исследованиям формирования нейронных цепей.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
