Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

Для сшивания с последующим иммунопреципитацией. Процедурные клетки с плотностью от 80 до 90% инкубируют с одним миллимоляром ледяного льда. DSP в PBS, только кальций, магний или ДМСО.

Управление транспортным средством. DSP - это гомобифункциональный мембранный проницаемый и редуцируемый сшиватель, который свободно сшивает и сшивает в пределах 12 ангстрем друг от друга. После этого клетки сшивания лизируются и проводится иммунопреципитация с использованием стандартных контрольных систем.

Белковые комплексы затем разрешаются путем восстановления страницы SDS, уменьшая DSP расщепленных агентов, что позволяет идентифицировать отдельные белки с помощью иммуноблоттинга. Здравствуйте, меня зовут Стефани Ик из лаборатории доктора Виктора Фонда на факультете клеточной биологии Университета Эмори. Меня зовут Перл Райдер, я тоже из лаборатории Fonde.

Сегодня мы покажем вам процедуру выделения комплексов myprotein с помощью контролируемого кросслинкинга с последующей иммуномагнитной аффинной хроматографией. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения переходных лабильных белковых взаимодействий. Итак, приступим.

Начните с маркировки нижней части клеточных пластин, чтобы указать тип клеток и конкретные условия эксперимента. Положительный символ здесь указывает на то, что обработка DSP включает в себя отрицательное управление транспортным средством только DMSO. Добавьте в пластины питательные материалы, чтобы подготовить их к клеточной посевной тарелке.

Клетки HEK засеивают в разведении от одного до пяти разбавлений, чтобы обеспечить выделение 500 микрограммов белка за стандартную реакцию в пробирке. Одной пробирки может быть достаточно для идентификации предполагаемых партнеров по связыванию представляющего интерес белка с помощью иммуноблоттинга из масс-спектрометрического анализа. Увеличьте количество стандартных реакций не менее чем в 10 раз.

Также подготовьте стебли из большинства растворов, используемых в эксперименте по сшиванию. К ним относятся PBS с добавлением 0,1 миллимоляра хлорида кальция и одного миллимолярного хлорида магния, называемого PBS кальциево-магнием. Добавление ионов кальция и магния имеет решающее значение для адгезии клеток к культуральной пластине.

В ходе эксперимента храните раствор при температуре четыре градуса Цельсия. Другие запасы включают в себя раствор для гашения сшивающего агента 50 X полный коктейль ингибиторов протеазы, который представляет собой вихревой раствор каждые 20 минут до тех пор, пока гранула не растворится. 20% Тритан Х 100, который хранится при четырех градусах Цельсия и должен быть использован в течение одного месяца и 10 х и один х Буфер А растворов.

Подготовьте и храните все растворы, как указано в сопроводительном письменном протоколе. Наконец, приготовьте буфер для лизиса, состоящий из одного X-буфера. Плюс 0,5% TRITTON X 100 и буфер для иммуномагнитного преципитации или IP-буфер, состоящий из одного X-буфера.

Плюс 0,1% TRITTON X 101 к двум дням после покрытия, плавность клеток составляет от 80 до 90% CO, что является оптимальным для сшивания. В условиях высокой беглости клетки имеют тенденцию нагромождаться друг на друга, что приводит к снижению доступности проницаемого сшивающего агента клетки ко всем клеткам. Поместите пластины обратно в инкубатор до тех пор, пока они не будут готовы к сшивке.

Приготовьте раствор DSP Crosslinker непосредственно перед нанесением на клетки. DSP обладает высокой гидрофобностью и поэтому растворяется в ДМСО до концентрации 100 миллимоляров перед разбавлением в кальциево-магниевый буфер PBS. Для дальнейшего усиления разведения DSP в кальциево-магниевый буфер PBS, теплый и соответствующий объем, добавьте 10 микролитров DSP и стоковый раствор ДМСО.

На каждый миллилитр теплого кальциево-магния PBS добавляйте исходный раствор D-S-P-D-M-S-O по каплям, повторяя перемешивание, пока весь DSP не растворится. Также приготовьте раствор для управления транспортным средством из 10 микролитров ДМСО на каждый миллилитр PBS кальция и магния. После разбавления DSP выдержите все растворы кальция и магния PBS на ледяной водяной бане не дольше 10 минут.

Далее приготовьте ванну с ледяной водой, которая будет удерживать все тарелки, использованные в эксперименте. Возьмите культуральные планшеты, содержащие клетки, из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и немедленно поместите их в ванну с ледяной водой. Промойте клетки дважды ледяным PBS кальцием и магнием, используя те же объемы, подготовленные ранее для инкубации с помощью сшивающего агента на шестерых, лунку рассчитайте по два миллилитра на лунку и так далее.

После второй стирки. Добавьте либо средство управления транспортным средством, которое представляет собой растворенный в буфере ДМСО, либо буферный раствор для сшивания DSP в клетки, инкубируйте на льду в течение двух часов и проверяйте примерно каждые 20 минут, чтобы убедиться, что все клетки покрыты раствором. Если некоторые клетки обнажаются, наклоните и поверните чашку, чтобы снова равномерно покрыть их, это нормально, если небольшое количество DSP выпадет в осадок.

Во время двухчасовой инкубации с клетками до окончания двухчасовой инкубации приготовьте один раствор для гашения XDSP, разбавив стебель кальцием и магнием PBS. Держите раствор на льду до тех пор, пока не используйте его, чтобы остановить реакцию сшивания, инактивировав DSP, который не вступил в реакцию. По истечении двух часов извлеките из ячеек растворы для управления автомобилем и сшивки.

Добавьте ледяной раствор для гашения DSP и выдерживайте на льду в течение 15 минут. Тем временем разбавьте полный запас коктейлей ингибиторов протеазы от одного до 50 в буфере для лизиса клеток. По истечении 15 минут промойте клетки два раза кальцием и магнием PBS.

Затем добавьте в клетки буфер для лизиса, содержащий ингибиторы протеазы, и вращайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. После 30 минут лизиса клеток с помощью скребка для сбора клеток из пластины. Обязательно держите лизаты на льду, чтобы свести к минимуму активность протеазы.

Вращайте лизаты клеток в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в настольной мини-центрифуге с максимальной скоростью 15 000 G. Пипетируйте надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулы. Проанализируйте уровень белка с помощью теста Брэдфорда и приступайте к иммунопреципитации. Начинайте подготовку к иммунопреципитации сразу после начала двухчасовой реакции сшивания в микроцентрифужных пробирках с винтовой крышкой.

Смешайте 30 микролитров иммуномагнитных шариков против IgG с 500 микролитрами буфера IP. Добавьте антитело против интересующей мишени. Соответствующее количество антител должно быть определено для каждого отдельного антигена.

В предварительных экспериментах возможный отрицательный контроль для гранул включает отсутствие антител, гранулы и гранулы антител контроля изотипа для связывания антитела IP с магнитными гранулами. Инкубируйте в коромысле с концевым концом в течение двух часов при комнатной температуре В конце инкубации быстро вращайте трубки и вставляйте их в магнитный держатель. Бусины будут концентрироваться сбоку от магнита.

Удалите раствор, содержащий несвязанные антитела, и сразу же промойте шарики, чтобы предотвратить их пересыхание. После двух промывок добавьте 500 микролитров одного микрограмма на миллилитр DSP-отрицательного или DSP-положительного клеточного лизата в соответствующие пробирки. Отрицательный контроль конкуренции пептидов может быть получен на этой стадии путем добавления иммуногенного пептида в концентрации, определенной в предварительных экспериментах, в смесь лизатных шариков.

Другим возможным отрицательным контролем, приготовленным на этой стадии, является только буферная или свободная от лизата реакция, приготовленная путем добавления 500 микролитров буфера для лизиса только в гранулы. Аккуратно суспендируйте бусины для проведения экспериментальных и контрольных реакций. Не делайте вихрей, так как это приведет к разрыву бусин, инкубируйте при четырех градусах с вращением из конца в конец в течение двух часов.

По истечении двух часов удалите лизат с помощью магнитного держателя. Быстро отжмите и промойте бусины в общей сложности шесть раз с одним миллилитром буфера IP. Инкубируя каждую стирку при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Чтобы избежать связанных комплексов, добавьте один буфер для гелевых образцов в пробирку IP прямо над гранулой гранул. Чтобы собрать шарики на дне пробирки, осторожно постучите по дну пробирки, чтобы все шарики снова взвесили в буфере для гелевого образца. В качестве альтернативы, для выделения иммуноаффинности в 30 мкл буфера добавляют иммуногенный пептид к гранулам.

Необходимая концентрация иммуногенного пептида определяется опытным путем. После тестирования в диапазоне от 10 до 200 микромоляров инкубируйте шарики при четырех градусах в течение двух часов, постукивая по трубкам каждые 30 минут. С помощью магнитного держателя удалите 30 микролитров, содержащих ускользающие комплексы, и сохраните в чистой пробирке промойте с IP-буфером и сохраните шарики.

Добавьте один х буфер для образцов геля в бусины для обоих методов элюирования. Нагрейте иммуномагнитные шарики, взвешенные в гелевом буфере для образца, при температуре 75 градусов Цельсия в течение пяти минут в дополнение к денатурации белков. На этом этапе молекула DSP также будет разделена, что позволит разрешать отдельные белки в сложном цикле.

Образцы на странице SDS гель для вестерн-блоттинга. Опорожненные иммуномагнитные шарики можно отталкивать центрифугированием и извлекать из образца с помощью магнитного держателя перед загрузкой. Если иммуноаффинное EUA не содержит IgG как при окрашивании белка страницы SDS, так и при иммуноблоттинге, он подходит для масс-спектрометрии.

Вот пример вестерн-блоттинга материала из сшитого и несшитого клеточного лизата с последующим иммуномагнитным преципитацией с использованием моноклонального антитела против трех субъединиц AP. Дельта-сшивание позволяет обнаруживать взаимодействующие белки, не наблюдаемые в несшитых образцах во время иммуномагнитных выделений. Отрицательный контроль не показал специфического снижения белка при использовании контроля без антител и контроля по изотипу антител с использованием IgG, направленного против рецептора трансферрина, как для несшитых, так и для сшитых образцов.

В этом примере использовали элюирование аффинного пептида для восстановления белков, связанных с антителом IP. Обратите внимание, что иммуноантитела отсутствуют во фракции суперната и остаются в фракции би во время элюирования пептида. Мы только что показали вам, как изолировать лабильные комплексы MultiPro с помощью химического сшивающего агента DSP с последующей иммуномагнитной аффинной очисткой.

При выполнении этой процедуры важно охлаждать клеточные растворы и лизаты, чтобы поддерживать лабильные взаимодействия во время сшивки и свести к минимуму активность протеазы. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.