Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.

В данном видео демонстрируется проведение высокопроизводительного скрининга на основе анализа изображений для оценки модуляции малыми молекулами сигнального пути Rasm MAP-киназы фактора роста фибробластов. Для этого трансгенных самцов и самок дикого типа данио-рерио скрещивают в специализированном садке для разведения. Оплодотворенные икринки оседают на дно, после чего их собирают и переносят в чашку Петри. Эмбрионы инкубируют в течение ночи, затем распределяют по отдельным лункам 96-луночного планшета с круглым дном.

Малая молекула BCI добавляется для гиперактивации сигнализации FGF, после чего планшет инкубируют в течение шести часов. Изображения каждой лунки фиксируют с помощью конфокального планшетного ридера и анализируют с использованием специально разработанного алгоритма, который определяет интенсивность флуоресценции в конкретных эмбриональных структурах. Здравствуйте, я Хиба Кадо из лаборатории доктора Майкла Чанга с кафедры микробиологии и молекулярной генетики Питтсбургского университета.

Здравствуйте, я Андреа Спок из Института по поиску новых лекарственных средств Питтсбургского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру разведения, отбора и размещения эмбрионов данио-рерио (zebrafish) в планшетах для химического воздействия. В 96-луночном планшете мы будем использовать трансгенные эмбрионы, которые служат репортерами активности факторов роста фибробластов, и обработаем их молекулой, гиперсоктивирующей данный путь.

Мы продемонстрируем, как использовать методологию высококонтентного скрининга для автоматического получения данных, анализа и количественной оценки активности фактора роста фибробластов в эмбрионах трансгенных zebrafish. В данной процедуре будет освещена платформа, позволяющая использовать трансгенных zebrafish и высокопроизводительный химический скрининг. Итак, приступим.

За два дня до начала обработки отберите гомозиготных трансгенных самцов данио-рерио и поместите их в индивидуальные нерестовые аквариумы. Установите в аквариумы перегородки, затем добавьте в каждый аквариум самку дикого типа и оставьте рыб в нерестовых клетках на ночь при температуре 28 °C. На следующее утро удалите перегородку. Через один час перенесите рыб в новый аквариум, а эмбрионы соберите с помощью пластического сита.

Перенесите эмбрионы в чашки диаметром 100 мм с раствором E3 и инкубируйте при 28 °C в течение шести-восьми часов. После инкубации осмотрите эмбрионы под стереомикроскопом. Для экспериментов подходят эмбрионы на стадии гаструляции.

На данном этапе удалите все неоплодотворенные эмбрионы, которые останутся на стадии одной клетки. Также удалите нежизнеспособные эмбрионы, которые выглядят непрозрачными или имеют отклонения в развитии. Затем добавьте свежий раствор E three и инкубируйте в течение ночи при 28 °C.

На следующий день поместите эмбрионы под флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы отобрать трансгенные эмбрионы, находящиеся на одной стадии развития и имеющие равномерную экспрессию GFP. У эмбрионов через 24 HPF наблюдается четко выраженная граница среднего и заднего мозга с интенсивной экспрессией GFP, а также сформированные глаза с GFP-положительной дорсальной сетчаткой. Такие эмбрионы активны, двигаются и извиваются в хорионе; для их перемещения используйте пластическую пастуровскую пипетку.

Перенесите эмбрионы в возрасте 24 HPF по одному в отдельные лунки 96-луночного планшета. С помощью микропипетки удалите из лунок излишки раствора E three. Затем с помощью многоканального дозатора добавьте по 200 µL раствора E three в каждую лунку.

Затем добавьте по 2 µL DMSO во все лунки в столбцах 1 и 12. После этого добавьте по 2 µL BCL, приготовленного в DMSO, следующим образом: 1 µM в столбцы 2 и 7; 5 µM в столбцы 3 и 8; 10 µM в столбцы 4 и 9; и 20 µM в остальные.

Добавьте 5 мкМ в колонки пять и 10. И, наконец, 25 мкМ в колонки шесть и 11. Теперь накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение шести часов при 28 °C.

Добавьте по 10 µL трикаина в каждую лунку, чтобы анестезировать эмбрионы на стадии 30 HPF. Затем поместите планшет в систему Molecular Devices ImageXpress Ultra с запущенным программным обеспечением MetaXpress. Выберите конфигурацию с 4x объективом и максимальным диаметром диафрагмы (pinhole).

Настройте функцию автофокусировки лазера для обнаружения дна планшета и используйте заранее определенное оптимальное смещение по оси Z. Для обнаружения интересующих областей установите область сканирования в виде одного участка размером 2000 на 2000 пикселей без биннинга. Выберите соответствующий тип планшета и аргоновый лазер с длиной волны 488 нм при длинах волн возбуждения и эмиссии 488 и 525 нм соответственно.

Затем выберите лунку с эмбрионом, подвергнутым воздействию контрольного вещества (плацебо), и нажмите «find sample». Прибор выполнит автоматическую фокусировку и сделает один снимок для подтверждения правильности захвата изображения. Случайным образом выберите лунку с контрольным веществом и сделайте снимок.

Если изображение находится в фокусе и демонстрирует экспрессию GFP в голове, поместите курсор над самыми яркими областями и убедитесь, что интенсивность флуоресценции находится в пределах диапазона 16-битной камеры — менее 65 000 единиц.

Повторите эти шаги с другим контролем растворителя и несколькими лунками, обработанными соединением. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и усиление так, чтобы самые яркие области на изображениях положительного контроля не были перенасыщены. Затем в окне сбора данных и управления планшетом выберите «acquire plate», чтобы начать сканирование планшета.

Прибор автоматически получит по одному изображению для каждой лунки всего микропланшета и архивирует их в базе данных SQL-сервера. После завершения сканирования загрузите изображения в D definition's. Developer, открыв developer с включенной опцией slinger.

Создайте новое рабочее пространство. Затем в меню «Файл» выберите «Настраиваемый импорт» (customized import). После этого перейдите в папку с изображениями и откройте образец файла.

Выберите фильтр импорта, который распознает формат изображений и структуру файлов, созданных платформой Molecular Devices ImageXpress Ultra. Теперь для обработки изображений откройте контрольное изображение и загрузите необходимую технологию когнитивных сетей (Cognition Network Technology, CNT), алгоритм или набор правил. Используемый здесь пользовательский алгоритм предназначен для автоматического определения эмбриона, желтка и головы, а также для количественной оценки яркости и площади экспрессирующих GFP структур головы; примените набор правил до этапа обнаружения головы и желтка.

Чтобы обеспечить правильное определение желточного мешка и головы, измените набор правил, отрегулировав порог обнаружения желтка, если он оказывается слишком большим или слишком малым. Затем выполните набор правил до этапа обнаружения ярких структур головы. Чтобы обеспечить правильное определение областей экспрессии GFP в голове, измените набор правил, регулируя порог обнаружения структур головы как кратные значения интенсивности фона до тех пор, пока обнаружение ярких структур головы не будет соответствовать визуальным наблюдениям.

Затем вручную примените весь набор правил к нескольким случайно выбранным изображениям эмбрионов, подвергшихся воздействию плацебо (vehicle), и изображениям положительного контроля эмбрионов, обработанных PCI. Чтобы запустить алгоритм для всех изображений планшета, выберите планшеты для анализа и нажмите «Analyze» (Анализировать), затем перейдите к оптимизированному набору правил и проведите анализ всех лунок.

С помощью встроенного планировщика задач пустые лунки или неоднозначные изображения будут автоматически исключены из анализа во время сканирования. Отображается непрерывно обновляемая карта отбора (keep map). Как данные, так и изображения доступны для визуального осмотра непосредственно во время выполнения анализа.

Численные данные и обработанные изображения сохраняются автоматически. После анализа всех изображений данные можно экспортировать в стороннее программное обеспечение, такое как Excel, GraphPad или Prism. На данном рисунке представлены архивные изображения сканирования контрольного образца и образца, обработанного BCI, с проведением и без проведения анализа CNT.

Внесенный зеленый флуоресцентный белок или GFP обнаруживается в глазу, на границе среднего и заднего мозга, а также в тройничных ганглиях трансгенных эмбрионов. Обратите внимание, что как интенсивность GFP, так и области экспрессии расширены. У эмбрионов, подвергнутых воздействию BCI, наблюдается дозозависимый эффект BCI на экспрессию репортерного гена GFP в трансгенных эмбрионах.

Концентрация, необходимая для достижения половины максимального эффекта, или EC 50, составила приблизительно 12 micromolar. Мы только что продемонстрировали вам, как скрещивать, собирать и распределять эмбрионы трансгенных zebrafish по 96-луночным планшетам. Мы добавили возрастающие концентрации PCI в качестве активатора сигнального пути.

Мы также продемонстрировали, как автоматизировать получение изображений трансгенных эмбрионов, и проанализировали эти изображения с помощью специально разработанного алгоритма на основе технологии когнитивных сетей. С помощью этого подхода нам удалось количественно и в градиентном режиме измерить эффекты активатора сигналинга фактора роста фибробластов, представляющего собой малую молекулу. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного отбора эмбрионов для минимизации вариабельности между образцами.

На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.