Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.
June 24th, 2010
Мы сообщаем о развитии системы автоматизированного визуализации и анализа данио трансгенных эмбрионов в виде пластин многоямного. Это демонстрирует возможность измерения зависит от дозы эффект маленькая молекула, BCI, на фактор роста фибробластов экспрессии гена репортера и предоставлять технологию для создания высокой пропускной экраны данио химических веществ.
В этом видео на основе изображений проводится скрининг с высоким содержанием для оценки низкомолекулярной модуляции фактора роста фибробластов Rasm map киназного пути Эмбрионы данио-рерио, трансгенных самцов и самок дикого типа данио-рерио спариваются в клетке для размножения. Оплодотворенные яйца падают на дно и собираются и перекладываются в чашку Петри. Эмбрионы инкубируют в течение ночи, затем помещают в отдельные лунки 96-луночной круглой нижней пластины.
Малая молекула BCI добавляется для гиперактивации передачи сигналов FGF, и планшет инкубируется в течение шести часов. Изображения с каждого воли захватываются с помощью считывателя конфокальных пластин и анализируются с помощью самостоятельно разработанного алгоритма, который сообщает об интенсивности флуоресценции в конкретных эмбриональных структурах. Здравствуйте, я Хиба Кадо из лаборатории доктора Майкла Чанга на факультете микробиологии и молекулярной генетики Университета Питтсбурга.
Здравствуйте, я Андреа Спок из Института разработки лекарств Университета Питтсбурга. Сегодня мы покажем вам процедуру разведения, отбора и подготовки эмбрионов рыбок данио для химической обработки. В 96-луночной пластине мы будем использовать трансгенные эмбрионы, которые сообщают об активности фактора роста стекловолокна и обработаны молекулой, которая гиперактивирует этот прошлый белый.
Мы покажем вам, как мы используем методологию скрининга высокого содержания для автоматического сбора, анализа и количественной оценки активности фактора роста фибробластов в эмбрионах трансгенных рыб данио. Эта процедура будет посвящена платформенной технологии для использования трансгенных рыб данио-рерио и высокопроизводительных химических экранов. Итак, приступим.
За два дня до лечения определите гомозиготных самцов трансгенных данио-рерио и поместите их в отдельные брачные аквариумы. Добавьте разделители в аквариумы, затем добавьте в каждый аквариум по самке дикого типа и оставьте рыб в садках для спаривания на ночь при температуре 28 градусов по Цельсию. На следующее утро снимите сепаратор Через час переместите рыб в новый резервуар и высыпьте зародыши в пластиковое сито.
Перенесите эмбрионы в 100-миллиметровые посуды с раствором Е три и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение шести-восьми часов. После инкубации рассмотрите эмбрионы под стереомикроскопом. Эмбрионы, пригодные для экспериментов, будут подвергаться газообразованию.
В это время удаляют все неоплодотворенные эмбрионы, которые останутся на стадии одиночных клеток. Кроме того, удалите нежизнеспособные эмбрионы, которые выглядят непрозрачными или деформированными. Затем добавьте свежий раствор Е три и выдерживайте в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия.
На следующий день поместите эмбрионы под флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы отсортировать трансгенные эмбрионы по схожей стадии и однородности. Экспрессия GFP 24 эмбрионов HPF демонстрирует видимую среднюю заднюю границу мозга с интенсивной экспрессией GFP и хорошо сформированные глаза с GFP-положительной дорсальной сетчаткой. Эти эмбрионы активны и будут двигаться и извиваться в своем корионе с помощью пластиковой пастбищной пипетки.
Перенесите 24 эмбриона HPF по одному в отдельные лунки 96-луночного планшета. С помощью микропипетки удалите излишки раствора Е три из лунок. Затем с помощью многоканального дозеттера добавьте в каждую лунку по 200 микролитров раствора Е три.
Далее добавьте по два микролитра ДМСО во все лунки в столбцах 1 и 12. Затем добавьте два микролитра БКЛ, приготовленных в ДМСО, следующим образом: один, микромоляр во второй и седьмой колонках. Пять микромоляров на три и восемь, 10 микромоляров на четыре и девять 20.
Микромоляры к столбцам 5 и 10. И, наконец, 25 микромоляров к столбцам 6 и 11. Теперь накройте пластину алюминиевой фольгой и выдержите ее в течение шести часов при температуре 28 градусов Цельсия.
Добавьте по 10 микролитров трики в каждую лунку, чтобы обезболить 30 эмбрионов HPF. Затем загрузите пластину в молекулярные устройства image express ultra open meta express software. Выберите конфигурацию с целью Форекс и максимальным диаметром отверстия.
Настройте лазерную автофокусировку для определения дна пластины и использования заданного оптимального смещения Z. Чтобы определить области интереса, установите область сканирования как один сайт размером 2000 на 2000 пикселей без изгиба. Выберите подходящий тип пластины и аргоновый лазер с разрешением 488 нм при возбуждении на длинах волн излучения 488 на 525 нанометрах.
Затем выберите лунку, содержащую носитель, обработанный эмбрионом, и нажмите кнопку «Найти образец». Прибор выполнит сканирование с автофокусировкой и получит одно изображение, чтобы подтвердить правильность получения изображения. Наугад выберите хорошо обработанное транспортное средство и приобретите изображение.
Если изображение находится в фокусе и показывает выражение GFP в голове. Наведите курсор на самые яркие области и убедитесь, что интенсивность флуоресценции находится в пределах диапазона 16-битной камеры. Менее 65 000 единиц.
Повторите эти действия с другим органом управления автомобилем и несколькими лунками, обработанными смесью. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и усиление таким образом, чтобы самые яркие области на положительных контрольных изображениях не насыщались. Затем в окне захвата и управления номерным знаком выберите Захватить номерной знак, чтобы начать сканирование номерного знака.
Прибор будет автоматически получать одно изображение для каждой лунки для всего микропланшета и архивировать их в базе данных SQL Server. После завершения сканирования загрузите изображения в определение D. Проявитель, открыв разработчик с включенной опцией slinger.
Создайте новое рабочее пространство. Затем в меню файлов выберите настраиваемый импорт. Затем перейдите в папку с изображениями и откройте файл с примером.
Выберите фильтр импорта, который распознает формат изображения и структуру файла, сгенерированную молекулярными устройствами платформы image express ultra. Теперь для обработки изображений откройте управляющее изображение и загрузите нужную технологию когнитивной сети или алгоритм или набор правил CNT. Пользовательский алгоритм, используемый здесь, предназначен для автоматической идентификации эмбриона, желтка и головы, а также для количественной оценки яркости и площади структур головы, экспрессирующих GFP, выполнения набора правил до стадии обнаружения головы и желтка.
Чтобы обеспечить правильное назначение желточного мешка и головы, измените набор правил, чтобы скорректировать порог обнаружения желтка, если желток слишком большой или слишком маленький. Далее выполните набор правил на этапе обнаружения светлых структур головы. Чтобы обеспечить правильное назначение областей, выражающих GFP в голове, измените набор правил, чтобы настроить порог обнаружения структур головы в кратных степени интенсивности до тех пор, пока обнаружение ярких структур головы не совпадет с визуальным наблюдением.
Затем выполните весь набор правил вручную на нескольких случайно выбранных изображениях, полученных от эмбрионов, обработанных носителем, и положительных контрольных изображений от эмбрионов, обработанных методом ЧКВ. Чтобы запустить алгоритм на всех изображениях пластин, выберите пластины для анализа и выберите их. Проанализируйте, затем перейдите к оптимизированному набору правил и проанализируйте все скважины.
С помощью встроенного планировщика заданий пустые скважины или неоднозначные изображения будут автоматически исключены из анализа во время сканирования. Отображается постоянно обновляемая карта хранения. Как данные, так и изображения доступны во время прогона для визуального контроля.
Числовые данные и обработанные изображения автоматически сохраняются. После того, как все изображения будут проанализированы, данные можно экспортировать в стороннее программное обеспечение, такое как Excel, GraphPad или призма. На этом рисунке показаны архивные изображения сканирования с обработанного автомобиля и хорошо обработанного ИМК с анализом УНТ и без него.
Применяемый зеленый флуоресцентный белок или GFP обнаруживается в глазу, средней и задней границе мозга и тройничных ганглиях трансгенных эмбрионов. Обратите внимание, что как интенсивность GFP, так и домены экспрессии расширены. У эмбрионов, получавших ИМК, наблюдается дозозависимое влияние ИМК на экспрессию репортерных генов GFP в трансгенных эмбрионах.
Концентрация, необходимая для получения половинного максимального ответа или EC 50, составляла примерно 12 микромоляров. Мы только что показали вам, как разводить, собирать и помещать трансгенные эмбрионы рыб данио в 96 луночных планшетов. Мы добавили увеличивающуюся концентрацию ЧКВ в собственном активаторе сигнального пути.
Мы также показали, как автоматизировать визуализацию трансгенных эмбрионов, и проанализировали изображения с помощью специально разработанного алгоритма, основанного на технологии когнитивных сетей. С помощью этого подхода мы смогли количественно и градуированно измерить эффекты низкомолекулярного активатора передачи сигналов фактора роста фибробластов. При выполнении этой процедуры важно помнить о тщательном выборе эмбрионов, чтобы свести к минимуму вариабельность между образцами.
Ну вот. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
Это исследование представляет систему для автоматизированной визуализации и анализа трансгенных эмбрионов данио в многобьёмерных пластинках. Оно демонстрирует возможность измерения дозозависимых эффектов малой молекулы BCI на экспрессию репортёрного гена фактора роста фибробластов, облегчая высокопроизводительные химические исследования данио.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Девелопментальная биология
- Высокопроизводительное скринирование
Бакграунд
- Данио часто используются в качестве модельного организма в девелопментальной биологии.
- Трансгенные данио могут экспрессировать флуоресцентные белки, позволяя визуализировать экспрессию генов.
- Высококонтентное скринирование позволяет анализировать множество образцов одновременно.
- Сигнализация фактора роста фибробластов (FGF) имеет важное значение для различных процессов развития.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительную систему визуализации для эмбрионов данио.
- Оценить эффекты малых молекул на сигнализацию FGF.
- Автоматизировать анализ экспрессии генов в трансгенных данио.
Использованные методы
- Разведение трансгенных данио и сбор эмбрионов.
- Инкубация эмбрионов в многобьёмерных пластинках с различными концентрациями BCI.
- Автоматизированная визуализация с использованием конфокального пластинкового ридера.
- Анализ флуоресцентных интенсивностей с помощью кастомного алгоритма.
Основные результаты
- Успешная визуализация и анализ эмбрионов данио в высокопроизводительном формате.
- Демонстрирование дозозависимых эффектов BCI на сигнализацию FGF.
- Автоматизированный анализ обеспечил надёжную квантификацию экспрессии генов.
- Создана платформа для будущих химических исследований у данио.
Выводы
- Разработанная система повышает эффективность химических исследований у данио.
- Она предоставляет ценный инструмент для изучения сигнализации FGF в развитии.
- Эта методология может быть применена к другим малым молекулам и сигнальным путям.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated imaging and analysis of zebrafish embryos enables scalable, in vivo assessment of signaling pathway modulation, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The approach provides quantitative, dose-dependent readouts that improve predictive confidence in compound effects on FGF/RAS/MAPK pathway activity. This positions the method as a translational bridge between phenotypic screening and lead identification in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating FGF signaling in a disease-relevant vertebrate system.
- Operational Value: Supports biological de-risking through automated quantification of GFP reporter expression in embryonic head structures.
- Predictive Value: Generates EC50 data (approximately 12 micromolar for BCI) to inform structure-activity relationships and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible fluorescent intensity readouts from 96-well plate formats compatible with high-throughput workflows.
- Scalability: Facilitates arraying of transgenic embryos at 24 hpf for compound treatment and automated imaging on confocal HCS readers.
- Algorithm Utility: The custom Cognition Network Technology algorithm detects and quantifies GFP expression in defined embryonic regions, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses zebrafish embryos at 24-48 hpf, a developmental stage with formed organs and tissue transparency, supporting in vivo-to-preclinical extrapolation.
- Mechanistic De-risking: Measures pathway-specific responses (FGF activation) to distinguish on-target from off-target compound effects.
- Biomarker Alignment: GFP reporter expression serves as a translational biomarker for FGF pathway modulation, detectable via automated image analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target confidence building through dose-response analysis of FGF signaling modulation.
- Screening: Delivers assay readiness via automated image acquisition and analysis, ensuring reproducibility across compound concentrations.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (GFP intensity and area) that allow comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using vertebrate embryos with conserved signaling pathways and visible organogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening multiple small molecules and signaling pathways using interchangeable transgenic reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated imaging and algorithm-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative, dose-dependent data on pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on EC50 and maximal response metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic embryo handling, and fluorescence microscopy.
- Dependent on confocal high-content screening instrumentation (e.g., Molecular Devices ImageXpress Ultra) and image analysis software (Definiens Developer).
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, compound preparation, and image acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations when applying the algorithm to different transgenic reporters or embryonic structures.
- Practical limitations include embryo variability and the need for careful specimen selection to minimize noise, as noted in the protocol.
