Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa
14 апреля 2010 г.
Эта процедура описывает, быстрый и простой рабочий процесс, чтобы ввести миРНК в трудные для трансфекции клеточных линий и следуйте экспрессии генов с ПЦР в реальном времени. Использование автоматизированных счетчик клетки, мульти-и электропорации пластины, и автоматизированные станции электрофореза обеспечивает быстрый и надежный результат, без потребности в дорогостоящих роботов обработки.
Общая цель данной процедуры заключается в использовании электропорации для введения siRNAs в труднотрансфицируемые клетки с целью изучения экспрессии генов. Это достигается путем предварительного определения необходимого объема клеточной суспензии с помощью автоматического счетчика клеток TC 10, после чего в суспензию добавляют irna и подвергают клетки электропорации.
При использовании системы электропорации MXL клетки инкубируют в течение 24 часов после электропорации. Затем добавляют IL-4 для индуцирования транскрипции генов в экспериментальных клетках. В завершение проводят экстракцию РНК и используют ПЦР в реальном времени для измерения уровней экспрессии генов.
В конечном счете можно получить результаты, демонстрирующие влияние специфических siRNA на пути экспрессии генов. Здравствуйте, я Адам Маккой, старший научный сотрудник отдела экспрессии генов Bio Rad Laboratories. Сегодня мы продемонстрируем процедуру введения РНК в труднотрансфицируемые клеточные линии методом электропорации, а затем рассмотрим влияние этого процесса на экспрессию генов.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для анализа экспрессии отдельных генов или изучения генных путей путем нокаута одного гена и анализа последующих эффектов. Итак, приступим. Работая в ламинарном шкафу для культивирования клеток, извлеките клетки из культурального флакона.
В данном протоколе используются суспензионные клетки. Если вы используете адгезивные клетки, перед их удалением потребуется обработка трипсином. Центрифугируйте клетки для получения осадка.
После центрифугирования клеток удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в PBS. Для определения количества живых клеток возьмите аликвоту клеточной суспензии и добавьте краситель трипановый синий в соотношении один к одному для окрашивания погибших клеток. Трипановый синий необходим для оценки жизнеспособности клеток, но не требуется для определения общего количества клеток.
Аккуратно перенесите смесь пипеткой в отверстие одноразового counting slide и вставьте его в автоматический счетчик клеток TC 10. Сначала TC 10 выполнит автоматическую фокусировку для обеспечения максимально точного подсчета, после чего начнется подсчет клеток. На дисплее отобразится количество живых и общее количество клеток на миллилитр в образце.
Выберите «view image» (просмотр изображения), чтобы вывести клетки на экран. Затем с помощью стрелок вверх или вниз увеличьте или уменьшите масштаб по мере необходимости, чтобы рассчитать объем клеточной суспензии, требуемый для экспериментов; выберите «dilution calculator» (калькулятор разведений).
Введите желаемые значения концентрации и конечного объема для данного эксперимента. Будет подготовлено в общей сложности 16 образцов, включая дубликаты для каждой группы обработки. Таким образом, потребуется всего 3.6 milliliters суспензии с концентрацией 5 × 10⁶ клеток на milliliter.
Затем счетчик клеток определит необходимый объем клеточной суспензии на основании количества живых клеток и введенных целевых значений. Если использовался краситель TRIAM blue, счетчик автоматически учтет произведенное разведение в соотношении один к одному. Теперь, работая в ламинарном шкафу, перенесите рассчитанный объем клеточной суспензии в новую пробирку.
Затем центрифугируйте смеси клеток до образования осадка. Пока клетки осаждаются, подготовьте микроцентрифужные пробирки для электропорации, добавив в каждую пробирку SIR A. Для данного эксперимента будут подготовлены один контрольный irna, две специфические siRNAs stat six и нерезецированные контроли. После центрифугирования удалите PBS и ресуспендируйте клетки в 3,6 milliliters буфера для электропорации gene Pulser, затем перенесите аликвоты по 800 microliter в пробирки с соответствующими IRNA и аккуратно перемешайте.
Теперь клетки готовы к электропорации для одновременной обработки всех образцов. С помощью системы электропорации MXL перенесите по 150 µL каждой клеточной суспензии в соответствующие лунки 96-луночного планшета для электропорации. Затем поместите планшет в камеру системы электропорации MXL и закройте крышку.
Выберите необходимый протокол электропорации и нажмите кнопку pulse. После завершения электропорации извлеките планшет из прибора и перенесите клетки в новый планшет для культивирования тканей, содержащий предварительно нагретую среду. Затем перенесите по 150 µL неэлектризованных контрольных клеток для каждого образца в новую чашку. После этого поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на ночь.
Через 24 часа используйте IL four для индукции транскрипции генов в одной группе клеток, а во вторую группу добавьте только среду. В клетки добавляют один IL four. Инкубируйте еще 24 часа при 37 °C и 5% carbon dioxide после общего периода роста в 48 часов.
Если экспериментальное воздействие влияет на деление клеток, могут возникнуть значительные различия в плотности клеточной культуры. Поэтому рекомендуется использовать автоматический счетчик клеток TC 10 для повторного быстрого подсчета клеток. Перенесите одну аликвоту из каждой лунки в микроцентрифужную пробирку для экстракции РНК и заморозьте.
Вторая аликвота предназначена для вестерн-блоттинга или другого анализа белков. Сегодня будет продемонстрирован только рабочий процесс выделения РНК. Центрифугируйте образцы для осаждения клеток.
Затем удалите и утилизируйте супернатант из каждой пробирки. Выполните экстракцию РНК с использованием набора для выделения общей РНК. После экстракции РНК немедленно приступите к анализу, поддерживая образцы на льду.
Для одновременной проверки качества и количества РНК используйте автоматическую станцию электрофореза Experian: подвергните образцы и маркер РНК Experian тепловой денатурации, затем поместите их на лед. Добавьте приготовленную смесь геля и красителя в лунку на чипе для РНК, установив код прайминга на станции прайминга.
Поместите чип в автоматическую станцию прайминга и нажмите кнопку пуска. Извлеките чип из станции прайминга и произведите загрузку чипа. Перемешайте образцы с загрузочным буфером с помощью вортекса.
Поместите чип в электрофорезную станцию и запустите анализ. Программное обеспечение Experian автоматически отобразит результаты в виде электрофореграммы, таблицы результатов с указанием концентрации РНК, рибосомального соотношения и показателя качества РНК (RQI), а также виртуального геля, который выглядит аналогично традиционному гелю для РНК. Образцы высококачественной тотальной РНК обычно имеют RQI от 8 до 10.
После проверки качества РНК подготовьте реакции cDNA. Для объединения синтеза cDNA и ПЦР в реальном времени используется смесь ONEstep RT-qPCR. Для каждой пары праймеров приготовьте мастер-микс, содержащий все компоненты реакции, за исключением матриц РНК.
Затем распределите смесь по лункам ПЦР-планшета. После доведения РНК до единообразной концентрации внесите образцы в соответствующие лунки в трех повторностях. Герметично закройте планшет, поместите его в амплификатор для ПЦР в реальном времени, выберите подходящий протокол и запустите анализ. По завершении анализа используйте кривые ПЦР в реальном времени для определения уровней экспрессии.
Программное обеспечение рассчитывает нормализованную экспрессию генов на основе данных об относительной экспрессии экспериментальных и референсных генов в обработанных и контрольных клетках. На этом рисунке представлен обзор сигнального пути IL 4: связывание IL 4 с его рецептором приводит к димеризации и активации STAT 6; активированный STAT 6 перемещается в ядро и активирует транскрипцию своих мишеней.
Транскрипция таких генов, как CCL 17, без индукции IL-4 будет оставаться на низком конститутивном уровне после сайленсинга гена STAT6 с помощью иРНК. Обработка IL-4 должна привести к незначительному увеличению или отсутствию повышения экспрессии CCL 17. Индукция CCL 17 под действием IL-4 измерялась при различных условиях методом количественной ПЦР в реальном времени.
Образцы для ПЦР, выращенные без IL-4, имели низкий конститутивный уровень экспрессии. Независимо от используемой миРНК, контрольные образцы A, обозначенные зеленым и синим цветами, нормально реагировали на обработку IL-4 с восьми-десятикратной индукцией CCL 17. Однако клетки, трансфецированные сиРНК против STAT6 (показаны красным и розовым цветами), продемонстрировали сниженную экспрессию CCL 17 в ответ на IL-4, что подтверждает гипотезу о том, что STAT6 играет роль в индуцируемой IL-4 экспрессии CCL 17.
Мы только что продемонстрировали вам способ электропорации siRNAs в труднотрансфицируемую клеточную линию суспензионного типа, а также метод отслеживания экспрессии генов в этих клетках. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости максимально строгого соблюдения единообразия условий для всех образцов. На этом все.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Обзор
В данной процедуре описывается рабочий процесс введения siRNA в труднотрансфицируемые клеточные линии и анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени. Использование автоматизированных систем повышает эффективность и точность данного процесса.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Экспрессия генов
- Методы электропорации
Введение
- Электропорация — это метод, используемый для введения нуклеиновых кислот в клетки.
- Линии клеток, трудноподдающиеся трансфекции, создают определенные сложности при изучении экспрессии генов.
- ПЦР в реальном времени является надежным методом количественного определения экспрессии генов.
- Автоматизированные системы позволяют оптимизировать рабочий процесс и улучшить результаты.
Цель исследования
- Для введения siRNAs в труднотрансфицируемые клеточные линии.
- Для оценки влияния siRNAs на пути экспрессии генов.
- Для использования автоматизированных методов с целью повышения эффективности.
Используемые методы
- Приготовление и подсчет клеточной суспензии с помощью автоматического счетчика клеток.
- Электропорация клеток с siRNA с использованием системы электропорации MXL.
- Индукция транскрипции генов с помощью IL-4.
- Экстракция РНК с последующим анализом методом ПЦР в реальном времени.
Основные результаты
- Успешное введение siRNA в труднотрансфицируемые клеточные линии.
- Количественное измерение уровней экспрессии генов.
- Демонстрация влияния специфических siRNA на генные пути.
- Высококачественные образцы РНК, пригодные для последующего использования.
Выводы
- Данная процедура эффективно способствует введению siRNA и анализу экспрессии генов.
- Автоматизированные системы повышают достоверность результатов.
- Этот метод может быть применен в различных исследовательских контекстах, связанных с экспрессией генов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный рабочий процесс обеспечивает эффективную доставку siRNA в труднотрансфицируемые суспензионные клетки, что позволяет проводить валидацию мишеней в исследованиях экспрессии генов. Автоматизированный подсчет клеток и электропорация повышают воспроизводимость и пропускную способность на этапах первичного поиска. Этот подход способствует механистическому снижению рисков при изучении таких сигнальных путей, как IL-4/STAT6, в онкологических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать транскрипционные регуляторы, такие как STAT6, в путях цитокинового сигналинга.
- Практическая ценность: Использование автоматического подсчета клеток для стандартизации входных концентраций с целью обеспечения стабильной эффективности трансфекции.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению рисков при выборе мишени путем установления связи между нокдауном с помощью siRNA и последующими изменениями экспрессии генов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные об экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени для анализа сигнальных путей.
- Практическая ценность: Интегрирует автоматизированный электрофорез для быстрой оценки качества и количества РНК.
- Масштабируемость: Система электропорации MXL позволяет одновременно обрабатывать несколько образцов в 96-луночном формате.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Использование клеток Namalwa, модели лимфомы Беркитта, для изучения IL-4-зависимой экспрессии генов, имеющей значение для иммуноонкологии.
- Механистическое понимание: Демонстрация роли STAT6 в индукции CCL17, что способствует валидации сигнальных путей, связанных с биомаркерами.
- Доклиническая преемственность: Верификация качества РНК обеспечивает надежность последующих этапов анализа, включая анализ белков и функциональные тесты.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая надежную модуляцию и количественное определение экспрессии генов.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез с помощью нокдауна узлов сигналинга в пути IL-4 с помощью siRNA.
- Скрининг: позволяет проводить воспроизводимую оценку воздействия соединений или генетических возмущений благодаря стандартизированной подготовке клеток.
- Аналитика: предоставляет количественные нормализованные данные экспрессии генов для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с системами, имеющими значение для заболевания, используя модели клеток лимфомы.
- Корпоративное повторное использование: автоматизированные платформы (TC10, MXL, Experion) могут быть использованы повторно в рабочих процессах с применением siRNA, CRISPR и трансфекции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях путей за счет специфического генетического воздействия.
- Операционная ценность: Автоматизация сводит к минимуму вариативность действий пользователя при подсчете клеток, электропорации и контроле качества РНК.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет повышения достоверности взаимосвязей между мишенью и сигнальным путем.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе функциональной валидации в моделях, релевантных заболеванию.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, электропорацией и нуклеиновыми кислотами.
- Зависит от наличия автоматического счетчика клеток, системы электропорации и установки для электрофореза.
- Необходима стандартизация протоколов экстракции РНК и контроля качества во всех группах исследователей.
- При адаптации следует учитывать различия в эффективности трансфекции адгезивных и суспензионных типов клеток.
- Практическое ограничение: для первичных или чувствительных клеточных линий может потребоваться оптимизация параметров электропорации.
