Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Общая цель данного эксперимента заключается в описании больших белковых сборок с помощью структурной масс-спектрометрии. Это достигается за счет подготовки позолоченных капилляров для ионизации электрораспылением nano flow. На втором этапе образец подготавливается, и масс-спектрометр калибруется для измерения больших масс.

Затем оптимизируются условия эксперимента для того, чтобы сохранить белковые комплексы нетронутыми в газовой фазе. Затем приобретаются MS и тандем Ms.Spectra. Спектры МС показали зарядовые состояния, соответствующие по массе интактному комплексу, в то время как тандемные эксперименты с МС дали ассоциативную картину мономеров и отрезанных комплексов.

Привет, я Наам Киба из лаборатории Мирона в Институте науки Уайтмена, и я Исаак Ки. Я также из лаборатории мишлона. Сегодня мы хотели бы показать вам базовую процедуру анализа больших белковых комплексов с помощью применения структурной спектрометрии, и мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для характеристики белковых комплексов для определения геометрии, состава и сетей взаимодействия. Итак, приступим.

Анализ нетокрентно связанных белковых комплексов проводят методом иммунизации воздушным распылением с использованием в качестве эмме плюс или ква капилляров. Этот капилляр C может быть притянут к тонкому кончику диаметром около одного микрона, а затем покрыт проводящим материалом, таким как золото. Эти капилляры коммерчески доступны, как вы можете видеть здесь.

Тем не менее, он гораздо более экономичен в использовании. Стеклянные капилляры, которые могут быть затем охлаждены и покрыты до готового к использованию состояния охлаждения, выполняются на этом устройстве для объединения игл и нанесение покрытия на этом устройстве для нанесения покрытия. Чтобы начать эту процедуру, приложите на дно чашки Петри две полоски двусторонней клеевой подушечки, держа полоски на расстоянии двух сантиметров друг от друга.

Поместите стеклянный стержень в центр одной из подушечек. Клейкая подушечка удерживает капилляры на месте, а стеклянный стержень поддерживает подготовленные капилляры и предотвращает поломку кончиков капилляров. Использованы капилляры из силикатного стекла Бориса с наружным диаметром один миллиметр и диаметром 0,78 миллиметра.

Вставьте один капилляр в иглу, аккуратно сожмите капилляр на месте и отрегулируйте его положение так, чтобы он лежал в центре нагревательной нити. Осторожно затяните зажимы до тех пор, пока капилляры не будут крепко держаться с обоих концов. Потяните капилляр с помощью предопределенной программы, показанной здесь.

Однако помните, что процесс программирования пуллера — это процесс проб и ошибок. До тех пор, пока не будет получена приемлемая форма кончика, каждый вытянутый капилляр дает начало двум капиллярам окончательной формы. Удалите вытянутые капилляры из инструмента и осмотрите наконечники, отбросив те, которые деформированы или сломаны.

Используйте тупой позиционирующий пинцет, чтобы поместить капилляры в чашку Петри. Основание капилляров прикрепляется к клеевой прокладке, а верхняя часть опирается на стеклянный стержень кончиком вверх. Продолжайте тянуть капилляры, пока чашка Петри не заполнится.

В блюдо диаметром 10 сантиметров помещается около 80 капилляров. Далее обмажьте капилляры золотом. Вставьте пластину в золотую напыляемую форму.

Убедитесь, что подача газа выбрана в соответствии с инструкциями производителя, и активируйте заданный цикл нанесения покрытия. Покрытие повторяют от трех до шести раз до тех пор, пока капилляры не станут равномерно золотистыми. Как только капилляры будут готовы, приступайте к калибровке масс-спектрометра.

Большинство экспериментов, проводимых на комплексах MultiPro, выполняются с помощью четырехкратного времяпролетного масс-спектрометра al Electrospray подобным образом. Inupt из воды, которая модифицирована для больших масс. Перед загрузкой образца белка откалибруйте масс-спектрометр с использованием йодида цезия.

Сначала приготовьте 100 миллиграмм на миллилитр раствора цезия в очищенной воде, цезий используется для калибровки высокой массы. Поскольку одиночно заряженные соляные кластеры простираются в широком диапазоне масс от 393 мачты до коэффициента заряда более 10 000. С помощью тупого пинцета возьмите покрытый покрытием капилляр из чашки Петри и загрузите в капилляр два микролитра раствора цезия.

Использование наконечника с гелем эйнора. Сдвиньте раствор к кончику капилляра вручную или с помощью адаптера с отжимным двигателем. Вставьте капилляр в держатель капилляра и отрегулируйте капилляр таким образом, чтобы наконечник находился примерно в 10 миллиметрах от края держателя.

Поместите капилляр под оптический микроскоп и с помощью острого пинцета типа АА обрежьте кончик. Важно убедиться, что в капилляре нет пузырьков воздуха, которые могли бы блокировать поток, и что капилляр не закупорен. Кроме того, следите за тем, чтобы золотое покрытие не содралось с капилляра.

Если это так, замените капилляр или обрежьте кончик и удалите непокрытую часть. Далее подключите держатель капилляров к интерфейсу nano flow ESI. Поверните столик XY, Z назад, чтобы не повредить капилляр, и переместите столик в активированное положение.

Капилляр должен располагаться на расстоянии от одного до 10 миллиметров от отверстия конуса. Применяйте капиллярное напряжение и низкое нанодавление потока до начала распыления. Затем попробуйте уменьшить давление нанопотока до минимального значения.

Оптимизируйте интенсивность сигнала, регулируя расположение каскада XYZ, капиллярное напряжение, давление нанопотока и поток газа для дисссольватации. Для детектирования широкого диапазона масс ряда сезонных пиков необходимо оптимизировать ускоряющие напряжения. Здесь используются следующие параметры: капиллярный конус образца от 1,3 до 1,7 киловольт, конус образца от 80 до 150 вольт, экстракционный конус, от одного до трех вольт для оптимизации пропускания ионов большой массы, которые требуют щадящих условий обессеменения.

Давление подпорки увеличивается до пяти-шести миллибар на начальной стадии вакуума между источником и анализатором. Чтобы повысить давление обратной силы, осторожно уменьшите проводимость исходной вакуумной линии к спиральному насосу, частично закрыв запорный клапан при одновременном контроле влияния на интенсивность сигнала. После завершения настройки масс-спектрометров соберите около 30 сканирований за один раз в секунду при соотношении заряда от 1000 до 15 000 после сбора данных откалибруйте время полета с помощью соответствующей калибровочной таблицы.

Теперь, когда калибровка завершена, образец белка можно загрузить. Образец подготавливается перед калибровкой масс-спектрометра, требуются низкие микромолярные концентрации. При необходимости сконцентрируйте образец с помощью центробежных ультрафильтрационных устройств.

Перед использованием убедитесь, что белковый комплекс не всасывается на мембрану устройства. При проверке объема и поглощения ультрафиолета для NESI можно использовать только летучие растворы, что часто приводит к необходимости буферного обмена. Колонна для фильтрации геля микроцентрифуги может быть использована для удаления всех следов солей, буферных молекул или любых других нелетучих аддуктов.

Вместо этого приостановите выборку. Водный раствор ацетата аммония. Этот критический шаг определяет качество спектров.

Повторите замену буфера до трех раз с минимальным разбавлением, менее 1,3 раза на устройство, пока не будет достигнут максимальный обмен. Если требуется как концентрация, так и буферный обмен, это можно сделать вместе с использованием центробежной ультрафильтрации, как показано в начале этого раздела. Затем загрузите образец, как показано на рисунке, для калибровки йодида цезия и начните распыление.

Начните с первоначальной оптимизации распыления до тех пор, пока сигнал не будет обнаружен. Используйте уравнение для показа среднего состояния заряда, в котором M — масса комплекса. У дальтонов, однако, точное положение зарядовых состояний зависит от белка.

Чтобы предотвратить сложную диссоциацию, не нагревайте источник железа. Либо выключите обогреватель, либо поддерживайте температуру ниже 40 градусов по Цельсию. Изменяйте положение капилляров, конус образца и напряжение экстрактора.

Чтобы максимизировать пропускание железа, возможной отправной точкой является напряжение конуса, конус экстрактора 100 вольт, один вольт и капиллярное напряжение 1,5 киловольта. Проверьте полученное изменение спектров. Оптимизируйте эти параметры в сочетании с нанодавлением потока для улучшения обожествления и удаления остаточной воды и буферных компонентов.

Увеличьте напряжение смещения в давлении газа в коллизионной ячейке. Типичные напряжения смещения находятся в диапазоне от 10 до 100 вольт при расходе газа ловушки от одного до 10 миллилитров в минуту. Выполняйте это осторожно, чтобы предотвратить ассоциацию комплекса, отрегулировать ловушку и передать энергию столкновения.

Часто для пропускания ионов большой массы требуются более высокие напряжения, обычно в диапазоне от 10 до 30 вольт. На этом этапе важно избежать диссоциации комплекса, вызванной столкновением, как показано здесь. После достижения стабильного сигнала рекомендуется снизить давление нанопотока и капиллярное напряжение до минимальных значений при сохранении стабильного распыления.

После сбора нескольких сканов приступают к идентификации компонентов комплекса методом тандемной масс-спектрометрии. После того, как получен оптимальный и устойчивый сигнал для белкового комплекса, выбирают ион-предшественник и устанавливают центр массы по ширине изоляции. Как правило, при низком массовом разрешении 12 и высоком массовом разрешении от 13 до 15 используется широкий диапазон масс для детектирования продуктов диссоциации с высокой массой и низким зарядом и последующего уменьшения его до желаемых значений для выполнения мс.

MS диссоциирует железо-предшественник Увеличивая энергию столкновения, сокращенно CE и давление на ячейку столкновения, увеличивайте либо ловушку, либо перенос CE постепенно, с шагом от 10 до 20 вольт, и повышайте давление столкновения газа до нуля до пяти миллилитров в минуту. Отслеживайте изменения спектров до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные условия активации. Высокая энергия активации может вызывать диссоциацию одной или нескольких субъединиц из интактного комплекса и прояснять сродство взаимодействия различных субъединиц.

Выберите несколько зарядов для анализа мс мс. В случае перекрывающихся компонент получение набора тандемных спектров MS помогает в разрешении зарядовых рядов различных популяций. Более того, более высокие зарядовые состояния диссоциируют легче по сравнению с более низкими зарядовыми состояниями, накладывающими MS и ms.

Ms спектров для валидации выделения выбранного иона-предшественника. В дополнение к характеристике интактного комплекса с помощью MS и ms. MS генерирует меньшие субкомплексы и раствор в условиях мягкой денатурации, а также характеризует их.

Анализ субкомплексов с помощью МС и мс МС является основой для определения субъединичной архитектуры комплекса для частичного нарушения субъединичных взаимодействий субъединиц, постепенного добавления органических растворителей до концентрации 50% или изменения рН раствора путем добавления аммиака или муравьиной кислоты до концентрации 4%; Для определения масс отдельных субъединиц, входящих в состав комплекса, важно получить спектр в условиях денатурации. Это можно сделать с помощью наконечника C four с соотношением воды и ацетонитрила от 25 до 75 с 1% муравьиной кислотой в качестве растворителя элуциана, при этом все собранные данные могут быть обработаны и проанализированы результаты, как подробно описано в прилагаемом письменном протоколе. Перед загрузкой образца белкового комплекса масс-спектрометры калибруются с использованием йодида цезия.

Серия одинаково расположенных пиков, отмеченных красным цветом, простирается в широком диапазоне от коэффициента заряда 393 до более 10 000. Они предназначены для одиночного заряда соляных кластеров общего состава комплекса цезий плюс. Дополнительные сигналы между основными пиками, отмеченными черным цветом, вызваны двойными и тройными зарядами серий комплекса цезия два плюс и комплекса цезия три плюс.

Увеличение давления на начальной стадии вакуума имеет важное значение для обнаружения кластеров с высокой массой. Влияние давления на пики с высокой массой показано здесь при обратном считывании давления 1,2 и 5,3 миллибар. Здесь показан расширенный масс-спектр для более высокого давления.

Вот пример масс-спектрометрии комплекса вариантов лектина, дающего распределение зарядового состояния между 3000 и 5000 коэффициентом основного заряда. Однако из-за адекватного обеззараживания ионов пики имеют широкие размеры. Увеличение напряжения смещения с 4 вольт до 15 вольт, что приводит к увеличению ускоряющих условий, приводит к зачистке остаточной воды и буферных компонентов, дающих спектр с высоким разрешением, измеряемая масса соответствует пентамерному комплексу.

Затем для анализа тандемных МС было выбрано состояние заряда плюс 15. Увеличение энергии столкновения приводит к высвобождению высокозаряженного мономера с центром в 1,664 основного заряда и обнаженного тетрамерного комплекса в диапазоне от 5,000 до 8,000 массового коэффициента заряда. Комплекс вариантов лектина также исследовался в условиях денатурации, что приводит к сложной ассоциации.

Таким образом, можно точно определить массу отдельных подразделений, составляющих комплекс. Мы только что показали вам, как получить MS и тандемные MS спектры ионов с высокой массой. При выполнении этой процедуры важно правильно подготовить образец и использовать только буферы летучести, совместимые с масс-спектрометрией.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.