В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Для понимания механизмов, регулирующих метаболизм и функции клеток, особое значение имеет расшифровка сетей взаимодействия молекул в живых клетках. Растущее число методологий, предоставляющих качественную и количественную информацию, является движущей силой на пути к получению целостной картины функционирования клетки. Методы ко-иммунопреципитации (Co ip), ТАП-мечения (TAP tag) или фотосшивки позволяют проводить очистку белковых комплексов in vitro.

Кроме того, было разработано несколько подходов для анализа белок-белковых взаимодействий в живой клетке. К ним относятся два гибридных скрининга или анализа комплементации флуоресцентных белков. Более того, для решения этой задачи были внедрены некоторые спектроскопические методы, такие как FRET или FCS, а также неспектроскопические методы.

Вышеупомянутые методы были разработаны для регистрации больших популяций клеток, однако они являются довольно косвенными и, следовательно, малопригодны для количественного анализа. В противовес им были предложены некоторые высокотехнологичные количественные подходы. Тем не менее, при стремлении к увеличению пропускной способности возникает сложность в сочетании возможностей высокопроизводительного анализа с возможностью получения количественной информации.

Недавно мы разработали новую концепцию идентификации белок-белковых взаимодействий. Метод микропаттернирования представлен здесь в виде схематической иллюстрации сеток SA с микропаттернированием BSA Sci five, которые наносятся на функционализированные стеклянные покровные стекла, при этом промежутки заполняются стрептавидином, а затем биотинилированными лигандами. В большинстве случаев используются антитела против мембраны.

Белок-приманка в клетках, выращенных на таких микробиомных чипах. Приманка будет расположена в плазматической мембране в соответствии с микропаттерном антител. Взаимодействия со вторым флуоресцентно-меченым белком-мишенью исследуются путем измерения степени совместного паттернирования. Используется кремниевый мастер и штамп из PDMS с массивом квадратов определенного размера и глубины.

Три микроштампа изготавливают из геля путем вырезания. Штампы предварительно промывают 100% ethanol и дважды дистиллированной водой, затем высушивают потоком азота. Их инкубируют с sci-fi в концентрации 0.67 mg/mL.

Раствор меченого BSA в течение 30 минут при комнатной температуре во время инкубации; покровные стекла, модифицированные эпоксидной смолой, очищают аналогичным образом. Таким же образом после нанесения чернил штампы промывают PBS и водой. Для переноса BSA sci five.

Штамп высушивают потоком азота и сразу после этого помещают под предметное стекло под собственным весом на 30 Minutes. Положение поля микрорисунка отмечают на обратной стороне покровного стекла. После извлечения штампов покровные стекла герметизируют с помощью адгезивных силиконовых масок.

Камеры заполняют раствором стрептавидина в концентрации 50 µg/mL, инкубируют в течение одного часа, после чего промывают 1 mL PBS. Затем паттерны стрептавидина инкубируют с биотинилированным антителом в концентрации 10 µg/mL в течение одного часа, и после промывки PBS в камеру вносят клетки. После прикрепления клеток к поверхности образец готов к измерениям.

Единственным требованием для считывания является наличие флуоресцентного микроскопа, способного освещать образец в конфигурации полного внутреннего отражения. Такие системы доступны в коммерческой продаже от различных поставщиков и за последние годы стали просты в использовании. Наша система детектирования установлена на эпифлуоресцентном микроскопе.

Для селективного возбуждения флуоресценции используемых флуорофоров применяются ионные лазеры на аргоне и криптоне; образцы освещаются в конфигурации полного внутреннего отражения с использованием объектива с высокой числовой апертурой (NA) и 100-кратным увеличением, погруженного в иммерсионное масло. После соответствующей фильтрации с помощью стандартных наборов фильтров изображение флуоресценции передается на ПЗС-камеру с обратной засветкой. Считывание данных осуществляется в режиме задержки и интегрирования, что позволяет сканировать большие области образца. Для этого образцы перемещаются с помощью моторизованного XY-столика, синхронизированного со сдвигом строк камеры.

Отраженный лазерный луч проецируется на двухсегментный фотодиод, а дифференциальный сигнал используется для управления Z-пьезоэлементом для быстрой перефокусировки. Ридер оснащен автоматической системой удержания фокуса, работающей в процессе сканирования: первое сканирование проводится на длине волны 488 nanometer для селективного возбуждения GFP, второе — на 647 nanometer для селективного возбуждения PS Five. Для анализа данных мы используем программу для расчета контраста, написанную в MATLAB, которая основана на интенсивности флуоресценции внутри и вне области захваченных антител.

Уровень контраста и, следовательно, степень взаимодействия белков анализируют для экспресс-анализа большого количества клеток. Также можно использовать имеющееся в продаже автоматизированное программное обеспечение. Например, программное обеспечение для визуализации scan R от компании Olympus было успешно протестировано для оценки контраста в экспериментах по микропаттернированию.

Мы анализируем хорошо известное взаимодействие белков CD4 и LCK в раннем сигналинге T-клеток, как показано здесь. Флуоресцентный LCK четко перераспределяется на областях, покрытых антителами к CD4. Нарушение структуры цинкового зажима, который является основным сайтом взаимодействия этих двух белков, путем добавления хелатора цинка впоследствии снижает контраст микропаттернов LCK.

Подводя итог, основными преимуществами метода микропаттернирования являются следующие: количественная оценка локальных пространственно-разрешенных белок-белковых взаимодействий; кроме того, возможность детектирования слабых взаимодействий, в том числе в плазматической мембране живых клеток, выявление модулированных взаимодействий между белками-приманками и белками-мишенями, анализ состояния покоя, а также применимость данного подхода для высокопроизводительного скрининга.