В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности
19 марта 2010 г.
Это видео показывает эксперименты с последующим анализом белок-белковых взаимодействий с помощью микро-узорной поверхности. Подход дает возможность выявления белковых взаимодействий в живых клетках и сочетает в себе высокую производительность с возможностями возможность извлечения количественной информации.
Для понимания механизмов, регулирующих метаболизм и функции клеток, особое значение имеет расшифровка сетей взаимодействия молекул в живых клетках. Растущее число методологий, предоставляющих качественную и количественную информацию, является движущей силой на пути к получению целостной картины функционирования клетки. Методы ко-иммунопреципитации (Co ip), ТАП-мечения (TAP tag) или фотосшивки позволяют проводить очистку белковых комплексов in vitro.
Кроме того, было разработано несколько подходов для анализа белок-белковых взаимодействий в живой клетке. К ним относятся два гибридных скрининга или анализа комплементации флуоресцентных белков. Более того, для решения этой задачи были внедрены некоторые спектроскопические методы, такие как FRET или FCS, а также неспектроскопические методы.
Вышеупомянутые методы были разработаны для регистрации больших популяций клеток, однако они являются довольно косвенными и, следовательно, малопригодны для количественного анализа. В противовес им были предложены некоторые высокотехнологичные количественные подходы. Тем не менее, при стремлении к увеличению пропускной способности возникает сложность в сочетании возможностей высокопроизводительного анализа с возможностью получения количественной информации.
Недавно мы разработали новую концепцию идентификации белок-белковых взаимодействий. Метод микропаттернирования представлен здесь в виде схематической иллюстрации сеток SA с микропаттернированием BSA Sci five, которые наносятся на функционализированные стеклянные покровные стекла, при этом промежутки заполняются стрептавидином, а затем биотинилированными лигандами. В большинстве случаев используются антитела против мембраны.
Белок-приманка в клетках, выращенных на таких микробиомных чипах. Приманка будет расположена в плазматической мембране в соответствии с микропаттерном антител. Взаимодействия со вторым флуоресцентно-меченым белком-мишенью исследуются путем измерения степени совместного паттернирования. Используется кремниевый мастер и штамп из PDMS с массивом квадратов определенного размера и глубины.
Три микроштампа изготавливают из геля путем вырезания. Штампы предварительно промывают 100% ethanol и дважды дистиллированной водой, затем высушивают потоком азота. Их инкубируют с sci-fi в концентрации 0.67 mg/mL.
Раствор меченого BSA в течение 30 минут при комнатной температуре во время инкубации; покровные стекла, модифицированные эпоксидной смолой, очищают аналогичным образом. Таким же образом после нанесения чернил штампы промывают PBS и водой. Для переноса BSA sci five.
Штамп высушивают потоком азота и сразу после этого помещают под предметное стекло под собственным весом на 30 Minutes. Положение поля микрорисунка отмечают на обратной стороне покровного стекла. После извлечения штампов покровные стекла герметизируют с помощью адгезивных силиконовых масок.
Камеры заполняют раствором стрептавидина в концентрации 50 µg/mL, инкубируют в течение одного часа, после чего промывают 1 mL PBS. Затем паттерны стрептавидина инкубируют с биотинилированным антителом в концентрации 10 µg/mL в течение одного часа, и после промывки PBS в камеру вносят клетки. После прикрепления клеток к поверхности образец готов к измерениям.
Единственным требованием для считывания является наличие флуоресцентного микроскопа, способного освещать образец в конфигурации полного внутреннего отражения. Такие системы доступны в коммерческой продаже от различных поставщиков и за последние годы стали просты в использовании. Наша система детектирования установлена на эпифлуоресцентном микроскопе.
Для селективного возбуждения флуоресценции используемых флуорофоров применяются ионные лазеры на аргоне и криптоне; образцы освещаются в конфигурации полного внутреннего отражения с использованием объектива с высокой числовой апертурой (NA) и 100-кратным увеличением, погруженного в иммерсионное масло. После соответствующей фильтрации с помощью стандартных наборов фильтров изображение флуоресценции передается на ПЗС-камеру с обратной засветкой. Считывание данных осуществляется в режиме задержки и интегрирования, что позволяет сканировать большие области образца. Для этого образцы перемещаются с помощью моторизованного XY-столика, синхронизированного со сдвигом строк камеры.
Отраженный лазерный луч проецируется на двухсегментный фотодиод, а дифференциальный сигнал используется для управления Z-пьезоэлементом для быстрой перефокусировки. Ридер оснащен автоматической системой удержания фокуса, работающей в процессе сканирования: первое сканирование проводится на длине волны 488 nanometer для селективного возбуждения GFP, второе — на 647 nanometer для селективного возбуждения PS Five. Для анализа данных мы используем программу для расчета контраста, написанную в MATLAB, которая основана на интенсивности флуоресценции внутри и вне области захваченных антител.
Уровень контраста и, следовательно, степень взаимодействия белков анализируют для экспресс-анализа большого количества клеток. Также можно использовать имеющееся в продаже автоматизированное программное обеспечение. Например, программное обеспечение для визуализации scan R от компании Olympus было успешно протестировано для оценки контраста в экспериментах по микропаттернированию.
Мы анализируем хорошо известное взаимодействие белков CD4 и LCK в раннем сигналинге T-клеток, как показано здесь. Флуоресцентный LCK четко перераспределяется на областях, покрытых антителами к CD4. Нарушение структуры цинкового зажима, который является основным сайтом взаимодействия этих двух белков, путем добавления хелатора цинка впоследствии снижает контраст микропаттернов LCK.
Подводя итог, основными преимуществами метода микропаттернирования являются следующие: количественная оценка локальных пространственно-разрешенных белок-белковых взаимодействий; кроме того, возможность детектирования слабых взаимодействий, в том числе в плазматической мембране живых клеток, выявление модулированных взаимодействий между белками-приманками и белками-мишенями, анализ состояния покоя, а также применимость данного подхода для высокопроизводительного скрининга.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод микропаттернинга для анализа белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Этот метод сочетает в себе возможности высокопроизводительного анализа с количественным определением, что позволяет обнаруживать слабые взаимодействия и модулировать взаимодействия между белками-приманками и белками-мишенями.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Белковые взаимодействия
Теоретическая часть
- Понимание сетей молекулярных взаимодействий имеет решающее значение для выяснения особенностей клеточного метаболизма и функций.
- Традиционным методам анализа белковых взаимодействий часто не хватает количественной точности.
- Необходимы новые методологии для получения целостного представления о клеточных функциях.
- Микропаттернинг представляет собой перспективный подход для прямого наблюдения белковых взаимодействий.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод количественного определения белок-белковых взаимодействий.
- Обеспечить возможность обнаружения слабых взаимодействий в живых клетках.
- Облегчить анализ динамических клеточных процессов.
Используемые методы
- Микропаттернирование поверхностей с использованием стрептавидина и биотинилированных антител.
- Флуоресцентная микроскопия для визуализации белковых взаимодействий.
- Программа для расчета контраста в MATLAB для анализа данных.
- Автоматизированное программное обеспечение для оценки экспериментов по микропаттернированию.
Основные результаты
- Успешное количественное определение локальных белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
- Продемонстрированное обнаружение слабых взаимодействий в плазматической мембране.
- Анализ взаимодействия белков CD4 и LCK в сигнальных путях T-клеток.
- Разработка надежного метода для высокопроизводительного анализа белковых взаимодействий.
Выводы
- Метод микропаттернинга представляет собой мощный инструмент для изучения белковых взаимодействий.
- Данный подход позволяет обнаруживать модулированные взаимодействия в живых клетках.
- Он обладает потенциалом для углубления нашего понимания клеточных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание сетей белок-белковых взаимодействий в живых клетках имеет решающее значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах разработки лекарственных препаратов. Данный метод микропаттернирования позволяет проводить количественный высокопроизводительный анализ слабых и модулированных взаимодействий непосредственно в плазматической мембране, обеспечивая прогностическую уверенность при проверке терапевтических гипотез. Этот подход способствует приоритизации портфеля препаратов за счет снижения биологической неопределенности в анализах взаимодействия с мишенью.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное исследование и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения пространственно разделенных белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
- Практическая ценность: Позволяет обнаруживать слабые взаимодействия в плазматической мембране, что способствует функциональной валидации мишеней в тех случаях, когда косвенные методы оказываются неэффективными.
- Прогностическая ценность: Позволяет измерять модулированные взаимодействия между «приманкой» и «добычей», что дает основание для принятия решений о продолжении или прекращении исследований на основе динамики взаимодействий.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем паттернирования мембранных белков в соответствии с микрочипами антител.
- Практическая ценность: Использование флуоресцентной микроскопии в конфигурации полного внутреннего отражения для получения количественных данных с пространственным разрешением.
- Масштабируемость: Совместимость с автоматическим сканированием предметного столика по осям XY и интеграцией с задержкой по времени для высокопроизводительного анализа больших популяций клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет анализировать взаимодействия в живых клетках в состоянии покоя и при модуляции, обеспечивая переход от этапа открытия к доклинической валидации.
- Механистическое снижение рисков: количественно определяет изменения взаимодействий при воздействии (например, нарушение связи CD4-LCK хелатором цинка), что способствует обоснованному продвижению разработки с учетом рисков.
- Соответствие биомаркерам: позволяет выявлять изменения в сетях взаимодействий, значимые для сигнальных путей, связанных с заболеванием.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, что позволяет проводить количественное профилирование взаимодействий перед скринингом соединений.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем картирования паттернов колокализации белков в живых клетках.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет использования стандартизированных микропаттернированных поверхностей и воспроизводимых показателей перераспределения флуоресцентных «добыч» (prey).
- Аналитика: позволяет проводить количественный анализ на основе контраста с помощью MATLAB или автоматизированного программного обеспечения, что обеспечивает статистическое сравнение силы взаимодействий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем анализа динамических взаимодействий в физиологически релевантных мембранных средах.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа для скрининга множества пар «приманка-добыча» (bait-prey) в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней за счет прямого количественного измерения белковых взаимодействий в живых клетках.
- Операционная ценность: Стандартизация с помощью микропаттернированных поверхностей и автоматического контроля фокусировки обеспечивает воспроизводимость результатов в разных экспериментах и разными пользователями.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет количественной оценки модуляции взаимодействий, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе данных о силе и динамике взаимодействий.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области мечения белков, микропаттернинга и флуоресцентной микроскопии.
- Необходимо оборудование для визуализации методом полного внутреннего отражения (TIRF) и моторизованный контроль предметного столика.
- Требуется стандартизация паттернирования антител и экспрессии флуоресцентного белка-мишени между исследовательскими группами.
- При адаптации метода следует учитывать различия в уровнях экспрессии мембранных белков и эффективности мечения белков-мишеней.
- Практические ограничения включают зависимость от доступности экзоплазматических доменов для связывания антител и возможные стерические препятствия, возникающие при микропаттернинге.
