$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
-Начните с размещения самоопыляющихся червей на их последней личиночной стадии на тарелках, засеянных бактериальным источником пищи. Позвольте личинкам развиться во зрелых взрослых особей, пока яйца не появятся в изобилии внутри червей и не будут отложены на тарелках. Вымойте тарелки с буфером, чтобы собрать яйца и червей.
Далее замените буфер раствором отбеливателя, который растворяет взрослых червей. Защищенные яичной скорлупой, эмбрионы выдержат эту обработку, хотя они будут находиться на разных стадиях развития. Затем замените отбеливатель буфером и дайте эмбрионам развиться. Поскольку личинки вылупляются из своей яичной скорлупы при отсутствии пищи, развитие приостанавливается на первой личиночной стадии.
Переложите личинок в тарелки с пищей, чтобы возобновить развитие. Это будет стимулировать синхронное продвижение через оставшиеся личиночные стадии.
Когда черви достигнут последней личиночной стадии, переместите их в тарелки с пищей и FUdR – ингибитором синтеза ДНК, препятствующим производству потомства. Непрерывное развитие в присутствии FUdR приводит к образованию популяции стерильных взрослых червей. В этом эксперименте мы синхронизируем популяцию нематоды C. elegans.
-Для начала перенесите личинки L4 желаемого генетического фона на свежезасеянный газон Escherichia coli на питательной среде для нематод или пластинах NGM. Используйте не менее двух 100-миллиметровых или трех 60-миллиметровых пластин для каждого штамма.
Инкубируйте червей при соответствующей температуре роста в течение трех-четырех дней или до тех пор, пока пластины не сконцентрируются с большим количеством яиц и червей. Смойте яйца и червей с пластин, используя примерно шесть миллилитров буфера M9 на 100-миллиметровую пластину нематод. С помощью стеклянных пастеровских пипеток переложите яйца и червей в отдельные центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров для каждого штамма. Вращайте эти трубки в течение трех минут при 6 180 g.
После центрифугирования аспирируйте буфер M9, сохраняя только животное и яичные гранулы. Добавьте три-четыре миллилитра раствора хлорной извести в каждую пробирку и периодически перемешайте в течение шести минут.
Затем добавьте буфер M9, чтобы заполнить каждую трубку, и вращайте при 6 180 г в течение одной минуты. Отсадите надосадочную жидкость и повторите эту промывку с М9 три раза.
После промывки переместите яичную гранулу в свежую 15-миллилитровую трубку, содержащую примерно девять миллилитров буфера M9. Синхронизируйте только что вылупившихся червей, охлаждая их при температуре 20 градусов Цельсия в течение 16–48 часов.
После вращения этих трубок при давлении 6180 г в течение 1,5 минут, поместите синхронизированных животных L1 на свежезасеянную лужайку OP50 на отдельных тарелках NGM. Держите пластины при температуре 20 градусов Цельсия до тех пор, пока животные не достигнут личиночной стадии L4 примерно через 42 часа. В это время используйте платиновую кирку, чтобы переместить личинки L4 в засеянные пластины NGM OP50, содержащие 0,5 миллиграмма на миллилитр FUdR, чтобы предотвратить их производство потомства.