дрозофила Анализ нор и туннелирования: метод оценки гипоксии тканей у личинок мух

- Чтобы установить клетку для сбора эмбрионов, используйте агаровые пластины из виноградного сока, дополненные свежей дрожжевой пастой, и поместите пластины на клетки, содержащие самцов и самок мухи дрозофилы соответствующего генотипа. Запах от дрожжей и виноградного сока привлекателен и способствует откладыванию яиц самками. Дайте отложить яйца на определенный срок. Затем удалите взрослых особей и инкубируйте зародышевые пластины в течение 24 часов до получения личинок первого возраста. Затем аккуратно перенесите несколько отдельных личинок из тарелки с виноградным соком на тестовую пластину, состоящую только из агара, где вырезано отверстие в агаре в центре пластины и заполнено дрожжевой пастой.

Молодые личинки должны питаться, чтобы набрать массу тела для развития, поэтому они зарываются в источник пищи — дрожжевую пасту. По мере развития личинки вступают в фазу блуждания и уходят от пищи в поисках места для окукливания. Чтобы оценить гипоксию, изучите схемы туннелирования, которые личинки образуют в субстрате. Отсутствие или недостаточное туннелирование является признаком кислородного голодания. В примере протокола мы увидим, как настроить анализ на закапывание и туннелирование.

- Настройте контрольные и экспериментальные генетические скрещивания в чашках для откладывания яиц, как описано в текстовом протоколе. Держите мух в темноте не менее двух дней до начала сбора яиц по времени. Для своевременного сбора яиц переложите взрослых особей на новые пластины виноградного агара, украшенные свежим мазком дрожжевой пасты, в начале дня и дайте взрослым яйцам отложить яйца на тарелки в течение четырех часов. Через четыре часа переложите взрослых особей в тарелки со свежим виноградным агаром.

Затем инкубируйте четырехчасовые сборные тарелки в течение ночи при температуре 25 градусов Цельсия. К следующему дню большая часть личинок уже вылупится. Планируйте иметь не менее 50 человек на каждую экспериментальную группу.

Для одного прогона анализа подготовьте не менее пяти пробирных пластин на каждую экспериментальную группу. Добавьте 16 грамм мухомора в 700 миллилитров деионизированной воды путем нагревания. Приготовьте 17,5 миллилитров Нипагена в 95% этаноле. Нагревайте агаровый раствор до его почти полного растворения. Затем добавьте в раствор агара раствор Нипагена и нагревайте до полного растворения агара. Немного остудите агаровый раствор, затем загрузите 10-сантиметровые пластины 15 миллилитров раствора агара. Как только агар загустеет, накройте пластины крышками и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение нескольких часов или на ночь.

Вяленый агар должен быть твердым на ощупь и не осыпаться при вырезании из него кусочков. После того, как агар застынет, с помощью пробкового сверла длиной 1,5 сантиметра сделайте центральное отверстие в агаровом геле на каждой пластине. Затем заполните отверстия аккуратно свежей дрожжевой пастой.

Чтобы перенести личинок на пробирную пластину, изготовьте простое средство. Согните изгиб в кончике пластикового микрошпателя и окуните кончик в дрожжевую пасту, чтобы он стал липким к личинкам. Теперь подхватите по отдельности первых личинок возраста и положите их на агаровую тарелку поближе к пищевой горке. Для каждой опытной группы подготовьте не менее пяти пластин с 10 личинками каждая.

Для обеспечения воспроизводимости между репликациями анализа крайне важно, чтобы на каждой пластине для анализа помещалось только 10 личинок. Обязательно внимательно проверьте контрольную пластину, чтобы определить, что одна и только одна личинка передается каждый раз, когда вы доставляете личинку с помощью наконечника микрошпателя.

Как только пластина будет загружена, наклейте на нее этикетку, накройте крышкой, затем поместите в темноту крышкой вверх при комнатной температуре. Осматривайте каждую пластину ежедневно, пока все личинки не умрут или не окукнутся. Вот примеры планшетов для штамма дикого типа со второго по восьмой день анализа. На второй день личинки закапываются в пищу и туннелирование не происходит. Прокладка туннелей начинается на третий день и достигает максимума между пятым и восьмым днями, когда личинки перестают блуждать и окукливаются в своих туннелях.

Аккуратно перенесите куколки с помощью изогнутой дразнящей иглы на виноградную тарелку и при желании посчитайте, сколько куколок закроют. Обратите внимание на формирование куколок и оцените их на наличие аномалий.