МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

Скрининг генов, ассоциированных с клеточным циклом, с помощью РНК-ИИ начинается с выбора подходящей миссии технологии нокдауна. Лёгкий. Библиотеки РНК от Sigma Aldridge используют высокую эффективность и специфичность эндорибонуклеазы, приготовленной si. Простые РНК представляют собой сложные пулы отдельных SI РНК, полученные путем ферментативного расщепления длинных двухцепочечных РНК, комплементарно таргетирующим пул МНК SI РНК, нацеленных на один и тот же транскрипт, повышают специфичность и предотвращают трудоемкий поиск эффективных и специфичных индивидуальных SI РНК.

Это делает легкую РНК особенно подходящей для больших и средних потерь функциональных экранов. Здесь мы показываем шаги, необходимые для проведения крупномасштабного скрининга глаз на основе РНК, начиная с настройки высокопроизводительного трансфекта и заканчивая разработкой соответствующего анализа. Примером этого является создание скрининга генов, участвующих в прогрессии клеточного цикла млекопитающих.

Во-первых, мы показываем, как оптимизируется трансфекция прикорневых клеток, а затем проводим статистическую оценку качества анализа. Наконец, проводится скрининг на уровне генома, измеряющий распределение клеточного цикла после истощения целевого гена. Попадания отбираются с использованием статистики zco и проверяются вторичными независимыми легкими РНК.

Кроме того, мы описываем потенциальные экспериментальные процедуры, которые могут быть использованы для наблюдения за РНК-экраном глаза. Привет, я Тай из Института молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка. И Тристан.

Меня зовут Франк Ал, я тоже из Института Маркса Планка в Дрездене. Сегодня мы покажем вам процедуру настройки скрининга потери функции в клетках млекопитающих с использованием простых РНК от Sigma Aldridge. Эссе по измерению распределения клеточного цикла в популяции клеток тканевой культуры будет использовано в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как гены могут быть связаны с биологическими процессами с помощью скрининга РНК-интерференции.

Итак, приступим. Каждый проект скрининга РНК-интерференции начинается с выбора триггеров сайленсинга, используемых эндорибонуклеаз, приготовленных si, РНК или сокращенно простых РНК, которые генерируются путем ограниченного ферментативного расщепления длинных двухцепочечных РНК с использованием трех РНК. Каждая легкая РНК проверяется на идентичность с помощью секвенирования и на чистоту с помощью анализа лабораторных чипов калипера.

Объединение отдельных миРНК, нацеленных на один и тот же транскрипт, повышает специфичность, поскольку каждая ирнка в пуле имеет одну и ту же мишень, в то время как побочные эффекты разбавляются. Таким образом, простые РНК обладают хорошей эффективностью подавления и высокой специфичностью мишени, что позволяет избежать побочных эффектов. Масштабирование генома легко.

Библиотеки РНК предоставляются компанией Sigma Aldrich. В 384 луночные пластины с краевыми лунками пустые. Кроме того, восемь позиций в центре пластины оставлены пустыми для органов управления.

Суббиблиотеки простых РНК представлены в 96 луночных планшетах, где все лунки заняты, клиенты могут решить, как легкие РНК будут расположены в этих планшетах. Отдельные простые РНК поставляются в виде отдельных пробирок. Трансфекция легкой РНК требует оптимизации для различных трансфекционных реагентов и клеточных линий.

Здесь оздоровляют наши клетки, культивируют в соответствии со стандартными процедурами и используют олиго в качестве реагента для трансфекции. Используйте ЭЭГ пять E-Z-R-N-A-A кинезиновый моторный белок, необходимый для биполярной сборки веретена, в качестве положительного контроля и запущенную РНК люциферазы в качестве отрицательного контроля. В 384-луночном планшете титруют различные количества легкой РНК, например, от одного нанограмма до 56 нанограмм с шагом в пять нанограмм и увеличивают количества трансфекционного реагента от 0,1 микролитра до 0,9 микролитра с шагом 0,05 микролитра.

После смешивания РНК и реагента для трансфекции добавьте клетки и инкубируйте в течение 48 часов. Когда инкубационный период закончится, проверьте клетки под световым микроскопом. Подсчитайте количество клеток, трансфицированных с помощью ЭЭГ.

Пять простых РНК, которые демонстрируют круглую форму, указывающую на митотический. Остальные также подсчитывают общее количество клеток, трансфицированных с отрицательным контролем. Гран ваниль люцифераза легкая РНК.

Оптимальные условия трансфекции показывают наименьшую токсичность для ванильлюциферазы и наиболее выраженный фенотип для ЭЭГ пять. Теперь, когда параметры трансфекции оптимизированы, переходим к настройке и первичному скринингу. Во избежание загрязнения автоматизированные пипетальные станции, такие как Matrix Wellm Mate или Tecan Aquarius, используемые для приготовления первичных сит, должны быть размещены под проточным колпаком пластинки.

Все используемые компоненты должны быть продезинфицированы перед использованием, либо путем автоклавирования, если это применимо, либо путем распыления 75% этанола перед экраном. Эти инструменты должны быть оптимизированы в соответствии с протоколами производителя. Оптимизируйте точность пипетирования для всех используемых компонентов на автоматизированной станции дозирования, поскольку параметры пипетирования изменяются в зависимости от типа объема раствора и типа планшета.

Эту оптимизацию необходимо повторять для каждого шага отдельно. Кроме того, оптимизируйте протоколы промывки таким образом, чтобы исключить перекрестное загрязнение от скважины к лунке после готовности автоматизированных станций дозирования. Трансфектируйте ячейки в формате 384 лунки с использованием предварительно определенных оптимизированных условий, чтобы убедиться в отсутствии позиционных эффектов.

Используйте простые РНК для ЭЭГ пять и ванильную люциферазу с чередующимся рисунком, покрывающим всю пластину. Оставьте все краевые лунки пустыми, так как распространенной проблемой при использовании многолуночных планшетов является усиленное испарение в краевых лунках во время инкубации. Это приводит к различным экспериментальным условиям в разных скважинах, что часто приводит к эффектам положения пластин для дальнейшей минимизации испарения, барьерам испарения сотрудников, таким как Corning, дышащей потолочной ленте.

Также следите за тем, чтобы инкубаторы содержались при повышенной влажности воздуха. Однако помните, что существуют возможные источники влияния положения, такие как изменение работы с жидкостью или система считывания, такая как считыватель пластин. После инкубации в течение 48 часов зафиксируйте клетки ледяным холодом, 100% этанолом в течение двух часов, затем регидратируйте в PBS в течение 15 минут.

Окрашивайте неподвижные клетки в течение 25 минут в PBS, содержащую один микрограмм на миллилитр DPI и 100 микрограммов на миллилитр РНК. Наконец, вымойте три раза с PBS и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Затем измерьте интенсивность флуоресценции DPI с помощью микроскопии.

Для каждого из них используется система сканирования Olympus. Хорошо осмотрите клетки и определите относительную интенсивность DPI. Создание гистограммы путем построения графика зависимости интенсивности DPI от номера ячейки на основе гистограммы.

Оцените распределение клеточного цикла, рассчитав процент клеток с содержанием ДНК А, два N для G, одну нулевую фазу G, между двумя N и четырьмя N для S-фазы, четыре, N для G, две фазы MPH и более четырех N для анеуплоидии или полиплоидии. Для того, чтобы оценить однородность результатов на планшете, сравнить распределение клеточного цикла между различными лунками путем сравнения процента клеток в G и M фазе для ЭЭГ 5 и люциферазного трансфекта Если результаты значительно отличаются на планшете, требуется дальнейшая оптимизация для устранения эффектов положения. Убедившись в согласованности результатов, рассчитайте статистические различия между положительным и отрицательным контролем.

Используйте приведенное здесь уравнение Z-фактора для определения статистической значимости результатов. SD означает стандартное отклонение, а AV — среднее. Z-фактор от одного до 0,5 указывает на статистически значимое отделение негативного контроля и шума от положительного контроля.

Если такая статистическая разница была установлена, можно переходить к основному экрану. Подготовка 384. Well tissue tissue culture plates для трансфекции легких РНК с использованием заранее определенных оптимизированных условий здесь.

15 нанограммов легкой РНК на лунку растворяются в пяти микролитрах TE-буфера. По меньшей мере восемь контрольных позиций на каждую пластину нагружены подходящими положительными и отрицательными элементами управления для биологического процесса. Изучал здесь, ЭЭГ пять и ранил люциферазу.

Простые РНК используются для того, чтобы избежать позиционных эффектов. Краевые лунки загружаются только пятью микролитрами TE-буфера. Затем добавьте пять микролитров opti MEM, содержащих 0,2 микролитра олиго, на лунку перемешайте и выдержите в течение 20 минут при комнатной температуре.

После смешивания РНК с реагентом для трансфекции добавляют сюда клеточную суспензию. Добавляют 40 микролитров суспензии R-клеток в концентрации 25 клеток на микролитр, что эквивалентно 1000 клеткам на лунку для инкубации в течение 72 часов. После 72-часовой инкубации.

Измерьте содержание ДНК на автоматизированном микроскопе, таком как Olympus scan R, как показано ранее. Повторите эту процедуру для всех пластин библиотеки для выбора хитов. Оцените значения содержания ДНК с помощью статистики Z-оценки.

Обратите внимание, что Z-оценка — это не то же самое, что Z-оценка Z-фактора. Обеспечьте статистическую меру значимости выборки по сравнению с отрицательным или имитационным контролем. Он рассчитывается в соответствии с приведенным здесь уравнением.

Рассчитайте zco для всех простых образцов РНК, используя сигнал для отрицательного контроля ванильной люциферазы в качестве эталона для выбора попадания, необходимо применить пороговое значение. Как правило, используется критерий значимости для Z больше двух или меньше минус двух. Однако, в зависимости от изучаемого биологического процесса или области применения скрининга, могут применяться различные пороговые значения.

Более сложные математические методы оценки, такие как Q, также могут быть использованы для выбора хитов. Затем выбранные хиты подвергаются вторичному скринингу и проверке HIIT. Вторичный скрининг выбранных генов HIIT следует за первичным скринингом для исключения ложноположительных результатов из-за экспериментальных вариаций.

Во-первых, проверьте выбранные совпадения, используя ту же процедуру, что и на основном экране, за исключением того, что настройте попадания с большим количеством повторений от трех до пяти, чтобы обеспечить лучшую статистическую оценку. Для проверенных попаданий используйте тот же анализ и считывание, что и в первичном скрининге, но с вторичной неперекрывающейся легкой РНК или другим неперекрывающимся триггером сайленсинга, таким как химически синтезированный Si. РНК В конечном итоге валидация выбранных генов путем скрещивания видов.

РНКИ спасает золотой стандарт верификации фенотипов РНК-интерференции, доступный на сегодняшний день. Короче говоря, бактериальная искусственная хромосома, сокращенно закодированная обратно, кодирующая ортолог от другого вида выбранного гена, стабильно трансфицируется в клетки. Задние конструкции сохраняют ген в его геномном контексте и обеспечивают почти физиологическую экспрессию.

РНК-интерференция против эндогенного гена оставляет экспрессию ортотрансгена неизменной, что спасает фенотип РНК-интерференции. Наконец, проверенные кандидаты были изучены более подробно, чтобы в конечном итоге прийти к механистическому пониманию. Во многих случаях РНК-интерференция может быть использована и в этих вторичных, более сложных анализах.

Например, покадровая микроскопия фенотипов РНК-интерференции. Вот пример скрининга клеточного цикла, в котором содержание ДНК в заживляющих R-клетках измерялось после нокдауна более чем 16 000 генов из генома человека. Было выявлено 1 351 первичное попадание, необходимое для деления клеток.

Во вторичном скрининге 743 попадания были проверены с помощью вторичного независимого триггера легкой РНК с использованием вторичного анализа. Нокдауны, которые приводили к аресту G two, отделялись от нокдаунов, которые приводили к митотическому аресту. Наконец, в рамках эксперимента по спасению РНК глаза для гена Lin 54 был использован для подтверждения его роли в правильном делении клеток.

Дальнейшие эксперименты показали, что истощение Lin 54 изменяет экспрессию многих генов клеточного цикла. Мы только что показали вам, как организовать высокопроизводительную трансфекцию миссии, простые РНК и анализ распределения клеточного цикла в клеточной линии культуры тканей человека. При проведении этой процедуры важно помнить, что условия трансфекции и анализы должны быть оптимизированы отдельно для каждой клеточной системы и любого биологического процесса.

Использование автоматизированных систем работы с жидкостями рекомендуется, но не является обязательным, особенно для небольших сит. Также возможна ручная обработка. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.