JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 2:59 мин • April 30th, 2023
- Под диссекционным микроскопом и в средах, дополненных сывороткой, удалите репродуктивный тракт у каждой мухи с помощью щипцов. Во-первых, удалите части пищеварительного тракта, которые могли сопровождать репродуктивный тракт. Чтобы изолировать добавочные железы и семявыводящий проток, удалите яички, эякуляторную луковицу и терминалии. Промойте салфетку в течение одной-двух минут в PBS, чтобы удалить сыворотку. Затем перенесите его в раствор диссоциации.
Чтобы подвергнуть клетки внутри желез воздействию диссоциативного раствора, удерживайте центр каждой железы щипцами и разрежьте железу парой острых щипцов. Удалите проксимальную часть железы и семявыводящий проток, чтобы оставить позади дистальный конец железы, содержащий редкую вторичную популяцию клеток, ответственную за секрецию белков, участвующих в спаривании. Наконец, перенесите наконечники дополнительных желез в микроцентрифужную пробирку для подготовки к сбраживанию. В следующем протоколе мы препарируем добавочные железы для выделения вторичных клеток для анализа транскриптома.
- Перед началом процедуры разрежьте и обжарьте круглые широкие 200 микролитровые наконечники для работы с железами и пропустите отверстие нескольких наконечников объемом 1000 микролитров рядом с пламенем менее чем на одну секунду, чтобы сузить отверстия. Затем отсортируйте модифицированные кончики от более узких к более широким в зависимости от скорости их аспирации. Для вскрытия добавочной железы поместите от 20 до 25 самцов дрозофилы в стеклянную посуду на льду и с помощью щипцов и диссекционного микроскопа удалите репродуктивный тракт одного самца мухи.
Очистите пару добавочных желез от всех остальных тканей, включая яички и эякуляторную луковицу, и перенесите добавочные железы на стеклянную пластину, содержащую среду с добавлением сыворотки комнатной температуры. Когда будет собрано 20 пар придаточных желез, промойте железы в посуде PBS в течение одной-двух минут при комнатной температуре. По окончании промывания переложите железы в свежеприготовленный диссоциационный раствор, а острыми щипцами под препарирующим микроскопом крепко защипните середину железистой доли.
С помощью второй пары щипцов разрежьте ткань острым кончиком, чтобы отделить проксимальную область добавочной железы и семявыводящий проток от части железы, содержащей вторичные клетки. Затем с помощью предварительно влажного пламени с закругленным широким наконечником пипетки объемом 200 микролитров перенесите сальники в трубку объемом 1,5 миллилитра.
В данной статье подробно описан протокол препарирования вспомогательных желез самцов Drosophila для выделения вторичных клеток с целью последующего анализа транскриптома. Метод включает аккуратное удаление репродуктивных тканей и тканей пищеварительной системы для получения желез, необходимых для дальнейшего исследования.
Точное препарирование и изоляция вторичных клеток вспомогательных желез самцов Drosophila позволяют проводить высокоточное транскриптомное профилирование в генетически доступной модели. Данный рабочий процесс поддерживает валидацию мишеней на ранних этапах и снижение механистических рисков в исследованиях репродуктивной биологии и секреторных путей. Воспроизводимость метода и его специфичность к типу клеток повышают прогностическую достоверность для последующего функционального геномного анализа и скрининговых приложений.
Данный протокол диссекции и изоляции применяется на этапе между предварительным поиском и идентификацией перспективных соединений, позволяя проводить надежный анализ специфических типов клеток для обоснования выбора мишени и проведения механистических исследований.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026