Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 4:49 мин. • April 30th, 2023
- Начните с того, что поместите чистую личинку под наркозом под стеклянную крышку головой вверх. Затем обнажите интересующую область, осторожно надавливая на крышку, чтобы свернуть личинку и отрегулировать ее положение. Используйте конфокальную визуализацию для определения местоположения нервных клеток личинок. Определите определенный аксон на одной из целевых нервных клеток в качестве места повреждения.
Затем подвергните аксон-мишень воздействию двухфотонного лазера с более высокой мощностью, чем используется для визуализации, чтобы вызвать повреждение. Двухфотонный лазер используется благодаря своей способности проникать и точно локализовать повреждения в живых тканях с минимальным повреждением окружающих тканей.
Немедленно прекратите лазерное воздействие при повреждении целевого нейрона, что приведет к аксотомии или разрыву аксона. Наконец, визуализируйте поврежденный нейрон, чтобы увидеть его дегенерацию и последующую регенерацию в желаемые моменты времени.
В примере протокола мы установим личинку для микроскопии, индуцируем повреждение сенсорных нейронов личинок и будем отслеживать регенерацию нейронов.
- Начните с обезболивания личинок. В вытяжном шкафу поместите 60-миллиметровую стеклянную тарелку в 15-сантиметровую пластиковую чашку Петри. Затем сложите лист папиросной бумаги и положите его в стеклянную посуду. Поместите пластину с виноградным агаром на ткань после добавления диэтилового эфира.
Затем на предметное стекло нанесите одну каплю масла галоидоуглерода 27 в центр и нанесите по пятну вакуумной смазки на каждый из четырех углов. Затем с помощью щипцов перенесите одну личинку на агаровую пластину и накройте стеклянную посуду для обезболивания личинки. Как только лава перестанет двигаться, осторожно перенесите ее в галоидоуглеродное масло с вертикальной головой. Затем наденьте на предметное стекло защитный листок и осторожно нажмите на него, пока он не коснется личинки.
Затем с мягкой силой сдвиньте защитное стекло, чтобы свернуть ячейки, которые будут удалены, туда, где двухфотонный лазер будет наиболее легко их поразить. Местоположение будет варьироваться в зависимости от того, на какие нейроны нацелены. Теперь закрепите сборку на предметном столике для двухфотонного микроскопа и сфокусируйтесь на интересующих клетках с помощью объектива с 40-кратным погружением в масло.
В программном обеспечении переключитесь в режим сканирования и загрузите сохраненный протокол. Убедитесь, что отверстие открыто до упора. Затем, в режиме реального времени, получите хорошее изображение интересующего региона.
Далее остановите сканирование в реальном времени, чтобы кнопка обрезки стала доступна. Используя функцию обрезки, отрегулируйте окно сканирования так, чтобы сфокусировать целевую область только на предполагаемом месте повреждения. Затем откройте новое окно изображения. Теперь уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Затем переключайте непрерывную кнопку, чтобы начать и остановить сканирование. Внимательно наблюдайте. Как только произойдет резкое увеличение флуоресценции, завершите сканирование.
Затем переключитесь обратно в исходное окно изображения и выберите режим реального времени, а затем найдите область, которая только что была выбрана, настроив фокус.
- Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевидной структуры или локализованных обломков прямо на месте травмы. Если мощность лазера будет слишком высокой, будет видна большая поврежденная область, которая может привести к летальному исходу.
- Теперь осторожно снимите крышку и переложите травмированную личинку на новую пластину с дрожжевой пастой. Выложите тарелку в 60-миллиметровую посуду вместе с пропионовой кислотой пропитанной тканью. Затем верните пластину к температуре культивирования.
Для последующей визуализации личинки используйте сохраненную конфокальную установку и соберите изображения с помощью 25-кратного объектива. Обязательно укажите точку нормализации, чтобы можно было количественно оценить регенерацию.